辽宁省玉竹根腐病病原鉴定及生物学特性研究

李晓丽，孙文松，刘 莹，李 玲，张天静

（辽宁省经济作物研究所，辽宁 辽阳 111000）

玉竹［PoLygonatum ordoratum（Mill.）Druce］为百合科（LiLiaceae）黄精属，为多年生草本植物，以根茎入药，具有养阴润燥、生津止渴等功效［1］。玉竹在中国大部分地区均有分布，是东北地区重要的道地药材之一。近年来，随着药用植物种植规模逐渐扩大，可利用土地资源不断减少，药用植物轮作周期缩短，种植年限增加，病害逐渐加重。本研究针对辽宁省玉竹主产区根腐病发生问题，采集病株并进行病原菌分离鉴定，旨在明确玉竹根腐病病原菌的种类及其生物学特性，为有效防控玉竹根腐病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病株采自辽宁省抚顺市清原县，具有玉竹根腐病典型特征。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离鉴定

1）病原菌分离培养与纯化。采用组织分离法分离病原菌。根茎表面消毒参照Li等［2］的方法并进行了一些改进，将采集的病害根部冲洗干净，从病健组织交界处切取1 cm长的根茎组织，70%乙醇消毒30 s后转入3%次氯酸钠溶液中消毒3 min，无菌水清洗3次后，放在无菌滤纸上吸干残余水分，将消毒后的根部剖开，剖面朝下置于察氏培养基中央，25℃黑暗培养，待长出菌落后，采用单孢分离法获得纯培养。

2）病原菌形态学鉴定。观察病原菌菌落的形状、颜色等特征，并在显微镜下观察病菌子实体形态并测量。

3）病原菌分子生物学鉴定。将活化后的病原菌接种于PD液体培养基，置于25℃、转速150 r/min的摇床培养5 d，离心收集菌体，采用Cenis方法提取总DNA，以其为模板，应用真菌通用引物EF1（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′）和EF2（5′-GGAAG TACCAGTGATCATGTT-3′）进行PCR扩增［3］，扩增产物委托北京鼎国生物工程技术公司测序。将所获得的拮抗菌株EF序列与GenBank数据库中的相关序列进行比对，并用DNAStar构建系统发育树，进行多序列同源性分析。

1.2.2 致病性测定

1）接种物准备。将供试菌株移植于PDA平板上，25℃培养7 d，用打孔器在菌落边缘打取直径5 mm菌饼5片，移入装有100 mL PD液培养基的三角瓶中，置于摇床120 r/min，25℃振荡培养7 d，然后用无菌水将培养液稀释成浓度为1×105个/mL的孢子悬浮液，备用。

2）盆栽接种。根据柯赫氏法则进行测定。将每1 kg灭菌土与200 mL（1×105个孢子/mL）孢子悬浮液充分混合，装入花盆中。取健康玉竹植株，将根茎用清水洗净，吸干表面水分，划伤根茎表皮，浸入菌液中0.5 h，移栽至花盆。用PD液培养基代替孢子悬浮液与等量灭菌土混合装入同体积花盆，以栽种划伤不接种的根茎为对照。每盆栽种3株，4次重复。

1.2.3 病原菌生物学特性研究

将在PDA平板上培养5 d的供试菌株，用直径为5 mm的打孔器在菌落边缘切取菌丝圆片，置于不同的条件下培养，研究其生物学特性。

1）最佳培养基。供试7种培养基为马铃薯蔗糖培养基（PSA）、马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、察氏培养基（CA）、水琼脂培养基（WA）、改良马丁氏培养基（MA）、玉米粉培养基（CMA）、胡萝卜培养基（HLB）。每个处理3次重复，置于25℃黑暗条件下培养6 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。

2）最佳碳源。以察氏培养基为基础，分别添加等量葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖，代替查氏培养基中的碳源，配制成不同碳源培养基，以不加碳源的察氏培养基为对照，每个处理重复3次。培养条件及测定方法同上。

3）最适氮源。以察氏培养基为基础，分别添加等量硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、尿素、牛肉膏，代替察氏培养基中的氮源，配制不同氮源培养基，以不加氮源的察氏培养基为对照，培养条件及测定方法同上。

4）最适宜pH。用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）无菌水溶液调节PDA培养基的pH至4、5、6、7、8、9、10、11共8个梯度，检测酸碱度对菌株生长的影响。

5）适宜温度。采用PDA培养基，培养温度为5～40℃，梯度为5℃，在不同温度条件下培养6 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。

6）适宜光照。采用PDA培养基，分别置于24 h黑暗、24 h光照、12 h光暗交替条件下培养6 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学鉴定

从玉竹病根中分离得到根腐病菌菌株，该菌株菌落圆形，突起絮状，初期白色，后逐渐变为浅粉色，菌丝体白色致密，大型分生孢子无色，镰刀形，略弯曲，多数为3隔，长度为8～16μm，小型分生孢子无色，单胞，卵圆形。其形态特征同董鲜等［4］报道的尖孢镰孢菌相似，从形态学上证明该病原菌为尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）。

2.2 病原菌分子生物学鉴定

以纯化后的病原菌YZGF-21为材料，利用EF1和EF2引物［5］对病原菌延长因子进行扩增，得到1条约600 bp的片段。通过测序获得片段长度为547 bp，在GenBank上进行Blast比对，显示与该序列同源性较高（95%以上）的序列均为尖孢镰孢菌，从中选取5株相似率最高的序列，再选取镰孢菌属芬芳镰孢菌（Fusarium redolens）、茄镰孢菌（Fusarium solani）、锐顶镰孢菌（Fusarium acuminatum）等病原菌序列，采用MEGA 7.0软件构建该菌株的系统发育树，结果如图1所示，菌株YZGF-21与尖孢镰孢菌（MN417151、MN417190、MN417191和MN417192）聚为一支，同源性较高，相似性达100%；菌株YZGF-21与芬芳镰孢菌、茄镰孢菌、锐顶镰孢菌聚为不同分支。综上所述，结合形态学、病菌生物学特性及分子鉴定，将菌株YZGF-21确定为尖孢镰孢菌。

图1 菌株YZGF-21序列系统发育树

2.3 致病性测定

接种后观察致病性的测定结果，接种8 d根茎上出现褐色小病斑，接种20 d病斑逐渐扩大，腐烂程度加重，叶片逐渐黄化枯死，植株倒伏。从发病根茎上重新分离的病原菌与接种病原菌相同。

2.4 生物学特性测定

2.4.1 不同培养基对病原菌生长的影响 由表1可见，病原菌在7种培养基上均能生长，在马铃薯葡萄糖培养基上生长速度最快，培养7 d后菌落直径可达71.8 mm，显著高于水琼脂培养基和玉米粉培养基。其次是马铃薯蔗糖培养基、胡萝卜培养基、察氏培养基、改良马丁氏培养基、玉米粉培养基、水琼脂培养基。可见马铃薯葡萄糖培养基最适合该病原菌生长。

表1 不同培养基对病原菌生长的影响

2.4.2 不同碳源对病原菌生长的影响 由表2可见，病原菌在5种碳源培养基和无碳察氏培养基（CK）中均可生长且差异不显著，在甘露醇为碳源的培养基上生长最好，培养7 d菌落直径可达75.1 mm，生长速度表现为甘露醇＞葡萄糖＞麦芽糖＞乳糖＞蔗糖＞对照（CK）。因此，适宜病原菌生长的碳源为甘露醇，其次为葡萄糖。

表2 不同碳源对病原菌生长的影响

2.4.3 不同氮源对病原菌生长的影响 由表3可见，病原菌在6种氮源培养基和无氮察氏培养基（CK）中均可生长，在硝酸钾为氮源的培养基上生长最好，培养7 d后菌落直径可达73.4 mm，与硝酸钠和牛肉膏氮源差异不显著，同其他氮源差异显著。6种氮源均显著高于CK。可见，适宜病原菌生长的氮源为硝酸钾，其次为硝酸钠和牛肉膏。

表3 不同氮源对病原菌生长的影响

2.4.4 pH对病原菌生长的影响 由图2可见，病原菌在pH为4～11时均可生长。在pH为6时生长最快，其次是pH为7和5时，三者之间差异不显著，菌落直径分别为79.5、78.8、72.4 mm。其余菌落直径由大到小依次是pH 8、9、4、10、11。可见，pH为5～7适宜该病原菌生长，最适pH为6。

图2 pH对病原菌生长的影响

2.4.5 不同温度对病原菌生长的影响 由图3可见，病原菌在10、15、20、25、30、35℃时均能生长，在5℃和40℃时无法生长，生长速度以25℃最快，菌落直径为79.5 mm，与30℃差异不显著，与其他处理间差异显著。其余菌落生长速度由大到小依次是20、15、35、10℃，相互间差异显著。可见，25～30℃适宜该病原菌生长，最适生长温度为25℃。

图3 不同温度对病原菌生长的影响

2.4.6 光照对病原菌生长的影响 由图4可见，病原菌在3种光照条件下均可生长，完全黑暗条件下生长最快，三者之间差异不显著。由此可见，光照对菌株生长的影响很小，最适生长的条件为完全黑暗。

图4 光照对病原菌生长的影响

3 小结与讨论

镰孢菌（Fusariumspp.）是一类在世界范围内广泛分布的土传病原真菌，约50%的镰孢菌植物病害由茄镰孢菌引起；其次为尖孢镰孢菌（约20%）引起，该菌寄主植物分布广泛，可引起西瓜、香荚兰、亚麻、黄芪、番茄、黄瓜、发财树、棉花等［5-12］多种植物发病。关于玉竹根腐病病原菌的鉴定，崔蕾等［13］鉴定湖南省新邵县玉竹为茄镰孢菌。吴金平等［14］鉴定湖北省玉竹为尖孢镰孢菌和烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）2种致病菌复合侵染；毕武等［15］研究表明湖南省邵东市玉竹根腐病的主要病原为芬芳镰孢菌。本研究鉴定来自辽宁省抚顺市清原县的玉竹根腐病病原菌为尖孢镰孢菌。可见，不同地区引起玉竹根腐病的病原菌种类有所不同。有关尖孢镰孢菌引起玉竹根腐病在南方玉竹产区已有报道，而在北方地区尚属首次。

尖孢镰孢菌生物学特性在其他植物上的研究报道较多，但不同地区、不同寄主的病原菌菌株生物学特性存在一定差异。香荚兰尖孢镰孢菌的最适生长温度为28℃，最适pH为6.5［6］。三七根腐病尖孢镰孢菌孢子最适萌发温度为30℃，pH为6，碳源为乳糖或淀粉，氮源为硝酸铵［16］。苜蓿根腐病尖孢镰孢菌适宜生长温度为20～30℃，pH为7～8，黑暗条件适宜生长，适宜培养基有PSA、SNA、YMM，最适碳源分别为可溶性淀粉和麦芽糖，最适氮源分别为尿素和蛋白胨［17］。建兰茎腐病尖孢镰孢菌生长及产孢最适温度为25℃，pH为7，光照条件为12 h光暗交替，碳源为α-乳糖，氮源为NaNO2［18］。本研究结果表明，该病原菌生长最适宜的培养基为PDA，碳源为甘露醇，氮源为硝酸钾，温度为25～30℃，pH为5～7，光照条件为完全黑暗。这说明尖孢镰孢菌在不同的寄主中生长的最适温度、pH、光照条件、碳源、氮源等有所差异。

本研究通过病菌形态学和分子生物学相结合技术，确定了中国北方玉竹根腐病种类，明确了玉竹根腐病病原菌生物学特性，阐明病菌生长与环境条件的关系，为玉竹根腐病的有效防治提供科学依据。