异鼠李素抑制H2O2诱导的黑素细胞ROS水平升高和细胞活性降低

王红娟，胡雯，雷子贤，康晓静

（新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科，新疆皮肤病研究重点实验室，乌鲁木齐 830001）

白癜风是一种慢性炎症性疾病，其特征是表皮黑色素细胞丢失引起的皮肤脱色。白癜风中黑色素细胞的破坏已被归因于多种病因学理论，氧化应激的发生和CD8+T细胞毒性的产生可直接导致细胞凋亡和分化[1,2]。白癜风的病因和发病机制尚不明确，较多学者支持氧化应激理论，氧化应激在白癜风的发生以及发展中起着重要的作用，可能破坏黑素细胞[3,4]，黑素细胞释放的HMGB1有助于形成氧化应激引起的白癜风自身免疫[5]。最近研究证明氧化应激有助于暴露源自黑素细胞的自身抗原，此外，氧化应激会促进角质形成细胞分泌促动素，从而介导皮肤白细胞病变中T细胞的浸润[6]。异鼠李素（isorhamnetin, ISO）属于黄酮类化合物，可抑制乙酰胆碱酯酶活性、氧化应激、细胞凋亡和炎症[7]。ISO可通过激活Nrf2并促使其下游靶基因（ERK1/2, PKCδ和 AMPK）的表达来发挥抗氧化应激作用[8]。目前关于ISO对人表皮黑素细胞抗氧化作用的研究未见报道，本实验初步研究在体外人表皮黑素细胞培养条件下，用ISO预处理黑素细胞，H2O2诱导人表皮黑素细胞氧化应激模型，通过对黑素细胞增殖、黑素合成的检测，研究ISO对黑素细胞氧化损伤的保护作用及对黑素合成的影响。

材料与方法

1 材料

M2黑素细胞生长培养基DEMEM/F12，含5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Promocell公司），0.25%胰酶（含0.02%EDTA）。异鼠李素（中国食品药品检定研究院），30% H2O2原液（美国sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（美国sigma公司），CCK-8试剂（日本Dojindo公司），左旋多巴（美国Sigma公司），活性氧检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2 黑素细胞培养

选用表皮分离吸疱仪在白癜风患者腹部吸疱6个（负压50 kPa，时间60~90min，每个疱直径0.8cm），待发疱看起来透亮后，用注射器将疱液吸出，注入5ml离心管中，0.22μm针头滤器过滤，-20℃保存。将疱壁沿基底边缘剪下，加入含青霉素及链霉素100U/ml的PBS，常温放置10min，PBS洗2~3次，将PBS吸干净，组织尽量剪碎，加入0.25%胰酶0.5ml，4℃消化12~16h后，黑素细胞培养基终止消化，吹打使细胞分散混浊，1500r/min离心3min弃上清，PBS洗2~3次，加入M2黑素细胞选择性培养基，置37℃，5%二氧化碳培养箱内培养，每3d更换培养基1次，并在显微镜下观察原代黑素细胞贴壁及生长状况，当黑素细胞达到80%以上融合后，进行传代培养。

3 黑素细胞增殖的测定

将传代细胞的浓度调整至1×104个/孔后加入96孔培养板，每孔150µl；24h细胞贴壁后吸去培养液，加入PBS，用10、20、40、60、80、100µmol/L的异鼠李素处理黑素细胞，并设立空白和阴性对照组，每一处理因素设立3个复孔，置37℃、5%C02条件下继续培养24h、48h、72h；于结束前4h，加入CCK-8液10ul/孔；置酶标仪于490nm波长测吸收光光度值；细胞增殖率=（样本组吸光度值-空白组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×l00%。

4 H2O2诱导黑素细胞氧化应激模型浓度筛选

将处于对数生长期的细胞消化，细胞计数后，细胞密度为 1×104个/ml，接种于96孔板中，每孔150µl，板周围一圈加 PBS100µl,以避免边缘效应，放入37℃，5%CO2，湿度95%以上的培养箱中培养。细胞贴壁进入对数生长期时加入含有不同浓度 H2O2的培养液 200µl，浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L和1.6mmol/L，对照组为培养基，培养箱中培养24h。按照 CCK-8 试剂盒操作步骤测定细胞活力，选取黑素细胞活力在50%（IC50）的 H2O2浓度进行后续实验。

5 ISO对人表皮黑素细胞增殖测定

将黑素细胞的浓度调整至1×104个/孔后加入96孔培养板，每孔150µl，细胞贴壁后吸弃培养基，用培养基中含有 10、20、40、60、80、100µmol/L 的ISO处理黑素细胞，并设空白和阴性对照组，每一处理因素设4个复孔，置37℃、5%CO2条件下继续培养24h、48h、72h后加入CCK-8液（10µl/孔），置酶标仪于490nm波长测各孔OD值。

6 ISO对H2O2诱导下人表皮黑素细胞增殖测定

将黑素细胞的浓度调整至1×104个/孔后加入96孔培养板，每孔150µl；24h细胞贴壁后吸去培养液，加入PBS，用预定剂量ISO预处理黑素细胞，并设立空白和阴性对照组，每一处理因素设立4个复孔，置37℃、5%CO2条件下继续培养24h，换液加入一定浓度的H2O2，共培养24h后，加入CCK-8液（10µl/孔）；置酶标仪于490nm波长测各孔OD值。

7 NaOH裂解法测定黑素含量

选择对数生长期细胞制成单细胞悬液后加入6孔板，每孔2×105个；24h细胞贴壁后吸去培养液，加入PBS，用预定剂量ISO处理黑素细胞，并设空白和阴性对照组，置37℃、5%CO2条件下继续培养72h；72h后弃上清液，收集细胞，血细胞计数器进行细胞计数（重复3次取平均值）；然后PBS洗涤2次，重新溶解于1mol/L NaOH 500µl；80℃烘箱2h后，将1mol/L NaOH加入96孔板，每孔 100µl，设4个复孔，置酶标仪于405nm波长测吸光度值：黑素含量=各孔吸光度值/各孔细胞密度。

8 流式细胞术检测细胞内活性氧水平

选择对数生长期细胞制成单细胞悬液后加入6孔板，每孔2×105个；24h细胞贴壁后吸去培养液，加入PBS，用预定剂量ISO处理黑素细胞，并设空白和阴性对照组，置37℃、5%CO2条件下继续培养24h，换液加入一定浓度的H2O2，共培养24h后，加入10µmol/L 二氯二氢荧光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）探针，孵育30min，PBS洗3次，收集细胞，250µl PBS重悬细胞，移入 5ml 流式管中，使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，空白组细胞调零，流式细胞仪检测实验组细胞内的DCF荧光强度。

9 统计学分析

使用GraphPad Prism 7软件对实验结果作图,数据分析采用SPSS 20.0统计软件对检测数据进行分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 原代培养黑素细胞的形态

原代培养的黑素细胞每间隔2d换液一次，M2培养基可选择性地杀伤成纤维细胞和角质形成细胞，对黑素细胞无影响。培养1周左右，倒置显微镜下可观察到呈梭型的黑素细胞，大部分细胞有2个树突，少部分有3个树突。由于表皮中黑素细胞含量较少，黑素细胞以点状辐射状生长， 不均匀地铺在瓶底（图1A）。约2周后，黑素细胞数量明显增多，连接成网状，达到90%以上融合，即可传代（图1B）。传代后的黑素细胞形态呈长梭型，镜下可观察到正在分裂增殖的黑素细胞（图1C）。

图1 原代培养黑素细胞形态的倒置显微镜观察。A，培养1周；B，培养2周；C，第1次传代。比例尺，100μmFig. 1 Invert microscopic observation for the morphology of melanocytes. A, cultured for 1 week; B, cultured for 2 weeks; C, after the first passage;scale bar, 100μm

2 H2O2诱导黑素细胞氧化应激模型浓度筛选

CCK-8法分析显示H2O2可浓度依赖性抑制黑素细胞活性：当H2O2浓度为0.4mmol/L时，黑素细胞活性被抑制约25%；H2O2浓度在0.8mmol/L时，黑素细胞活性被抑制40%~50%；H2O2浓度在1.6mmol/L时，黑素细胞活性被抑制60%~80%（图2）。细胞活性抑制率较低时（如25%左右）难以得到显著的药物作用，细胞活性抑制率过高时（如60%以上）较难得到药物保护作用，细胞活力抑制率在40%~50%时能更有效的观察药物作用，因此H2O2浓度为 0.8mmol/L应为最佳刺激条件。

图2 H2O2对黑素细胞细胞活力影响的CCK-8法分析（24h）。与对照组比较：*0.01

3 ISO增强人表皮黑素细胞活性

不同浓度ISO处理黑素细胞不同时间后进行CCK-8分析显示：10 mmol/L、20µmol/L、40µmol/L、60µmol/L、80µmol/L及100µmol/L ISO处理黑素细胞24h和48h后，细胞活力无明显变化；处理72h后，60μmol/L ISO可显著增加黑素细胞活力（图3）。

图3 ISO对黑素细胞细胞活力影响的CCK-8分析。与对照组比较：*0.01

4 ISO抑制H2O2对人表皮黑素细胞的毒性

CCK-8法检测显示：60μmol/L ISO预处理24h再以0.8mmol/L H2O2处理24h或48h的人表皮黑素细胞，其活力显著高于未用ISO预处理的0.8mmol/L H2O2刺激的细胞的活力（图4），表明ISO对氧化应激下黑素细胞具有保护作用。

图4 ISO对H2O2人表皮黑素细胞活力抑制作用的影响。A，H2O2处理24h；B，H2O2处理48h。与对照组比较：*0.01

5 ISO双向调节人表皮黑素细胞黑素合成

NaOH裂解法测定显示，不同浓度ISO对人表皮黑素细胞合成黑素具有双向调节作用：20μmol/L ISO抑制黑素细胞合成黑素，而80μmol/LISO对人表皮黑素细胞的黑素合成具有促进作用，但当ISO浓度进一步升高时，黑素细胞黑素的合成又被抑制（图5）。

图5 ISO对人表皮黑素细胞黑素合成的影响。与对照组（0µmol/L ISO）比较：*0.01

6 ISO预处理对H2O2处理后人表皮黑素细胞内ROS水平的影响

采用DCFH-DA探针对ROS水平进行流式细胞术检测显示：0.8mmol/L H2O2处理 24h 后，细胞内ROS水平较对照组显著升高，而以60μmol/L ISO预处理24h再用0.8mmol/L H2O2处理细胞，细胞内ROS水平的升高显著减少（图 6）。

图6 ISO预处理对H2O2诱导人表皮黑素细胞ROS产生的影响。H2O2组 vs control组：*0.01

讨 论

研究表明，氧化应激在白癜风的发病中起着至关重要的作用，处于进展期白癜风患者表皮中H2O2水平显著升高[9]。白癜风患者血浆中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶显著高于正常人[10]，表明白癜风患者体内氧化—抗氧化平衡被打破，大量ROS在体内蓄积导致表皮和真皮多种细胞出现氧化损伤。H2O2可使黑素细胞ROS含量增高，氧化应激可能是引起黑素细胞凋亡的重要原因，而白癜风皮损及皮损边缘存在黑素细胞凋亡[11]。说明H2O2可激活黑素细胞氧化应激，可作为白癜风氧化应激模型。

通过预实验，我们选择4个H2O2浓度处理正常人表皮黑素细胞，检测细胞活力发现，随着H2O2浓度升高，黑素细胞活力呈逐渐下降趋势，H2O2浓度为0.8mmol/L时下降较为明显，但细胞活力仍保持在50%以上，说明此浓度下既可诱导黑素细胞产生氧化应激状态。因此，选择H2O2浓度为0.8mmol/L作为最佳构建正常人黑素细胞氧化应激模型的条件。有研究报道，ISO对H2O2引起的H9C2细胞氧化应激损伤有保护作用[12]，ISO通过增强抗氧化防御系统、胆碱能神经传递和突触可塑性而促进潜在学习、记忆和认知功能[13]。本研究选用不同浓度ISO和不同处理时间刺激黑素细胞，显示ISO可促进黑素细胞增殖，最终选用60μmol/LISO预处理黑素细胞。CCK-8法观察ISO对0.8mmol/L H2O2诱导的细损害具有保护效应，60μmol/L ISO预处理能显著抑制H2O2降低人黑素细胞活力的作用，进一步说明ISO具有抗氧化作用。

黑色素细胞起源于神经嵴，占表皮细胞8%[14]。黑素细胞合成黑素，黑色素生成以后从黑色素细胞的树突传递至角质形成细胞[15]。在B16F10细胞中，ISO可显著增加黑素生物合成基因MC1R、MITF、TYR、TYRP1和DCT的表达及提高酪氨酸酶活性[16]。本研究发现，低浓度的ISO对人表皮黑素细胞的黑素合成具有抑制作用，随着ISO浓度的增高，人表皮黑素细胞的黑素含量也增高，80μmol/L时人表皮黑素细胞的黑素含量高于对照组。160μmol/L人表皮黑素细胞的黑素含量低于对照组，说明ISO较高浓度时可促进人表皮黑素细胞的黑素合成，但ISO浓度到达一定峰值时，对人表皮黑素细胞的黑素合成就会减弱。

氧化应激以线粒体依赖的方式诱导黑素细胞凋亡。ROS在线粒体内累积，引起线粒体膜电位丢失，可激活细胞色素C的释放及caspase级联反应，最终导致黑素细胞凋亡[17]。H2O2介导的氧化应激在黑素细胞丢失中起主要作用从而介导白癜风发生发展，研究表明，进展期白癜风患者红细胞和中性粒细胞中活性氧的生成明显高于健康对照组[18]，由于高水平的活性氧，白癜风患者表皮的抗氧化系统受损。同时，与正常黑素细胞相比，白癜风黑素细胞表现出高氧化应激水平和低抗氧化酶活性，使其对H2O2诱导的氧化应激更敏感[19]。在本研究中，ISO可降低H2O2诱导的人表皮黑素细胞内ROS水平，说明ISO可增强黑素细胞抗氧化应激的能力，从而保护人表皮黑素细胞免受氧化应激的损害。

总之，本研究表明黑素细胞活力可随H2O2浓度增加、处理时间的延长而下降，还发现了ISO可减轻H2O2对人表皮黑素细胞活力的影响，在一定浓度时，ISO对人表皮黑素细胞的黑素合成具有促进作用，说明ISO对H2O2引起的正常人表皮黑素细胞的氧化损伤具有保护作用。本实验结果为抗氧化剂ISO应用于白癜风的治疗提供了一定的实验基础，提示了ISO在白癜风治疗中的潜在价值。