病理组织芽生菌感染的特殊染色方法分析

谢文林，唐翠兰，连家燕*

（1中山大学附属第七医院病理科，深圳 518107；2中山大学附属第一医院病理科，广州 510080）

着色芽生菌病（chromoblastomycosis，CBM）是由多种暗色真菌引起的皮肤和皮下组织的慢性肉芽肿性疾病[1]。CBM的确诊须借助组织病理和真菌学检查。病理组织可见厚壁棕黄色孢子，同时伴有表皮假上皮瘤样增生、化脓性肉芽肿性炎、纤维增生机化等病理改变，具有诊断意义。真菌学检查主要包括脓液或皮损组织直接镜检，可见棕色圆形厚壁分隔的孢子（硬壳小体）[2]。本研究对15例已明确诊断为芽生菌感染的石蜡包埋组织同时进行PAS染色、六胺银染色、抗酸染色和爱尔新蓝染色（pH2.5），比较这4种染色方法检测显示病变组织中芽生菌的优缺点，探讨哪一种特殊染色方法更适合于临床病理诊断。

材料与方法

1 材料

选取中山大学附属第一医院2008~2021年及中山大学附属第七医院2018~2021年病理送检组织中诊断为芽生菌感染病例共15例，所选标本均经4%中性缓冲甲醛溶液固定，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，连续切片5张，切片厚度4~5μm。

2 染色方法

2.1 爱尔新蓝染色（pH2.5）

常规切片，脱蜡至水后，爱先蓝液（pH2.5）染15~20min，蒸馏水稍水洗，核固红染3~5min，蒸馏水稍洗，常规脱水、透明、中性树胶封片。

2.2 抗酸染色

常规切片, 汽油松节油混合液脱蜡至水后，滴入苯酚碱性品红液于室温染色30~40min，流水冲洗3~5min，20%硫酸分化1~2 min，流水冲洗3min，Mayer苏木素复染1min，流水冲洗5min， 于56~60℃烤箱烘干，二甲苯透明、中性树胶封片。

2.3 PAS染色

常规切片，脱蜡至水后，0.5%高碘酸氧化15min，蒸馏水冲洗1min，8%铬酸氧化15min，蒸馏水洗1min，无色品红液加盖避光于42℃水浴箱中染5min，流水冲洗3min，Mayer苏木素复染30s，返蓝液返蓝20s，流水冲洗1min，常规脱水、透明、中性树胶封片。

2.4 六胺银（PASM）染色

常规切片，脱蜡至水后， 8%铬酸氧化30min，蒸馏水洗1min，1%偏重亚硫酸钠水溶液1min，蒸馏水洗3min，入六胺液工作液于60℃水浴箱内40-60min，蒸馏水洗3min，0.1%氯化金调色2~3min，蒸馏水洗3min，3%硫代硫酸钠处理3~5min，流水冲洗3min, 水溶性伊红复染3~5 min，常规脱水、透明、中性树胶封片。

结 果

在HE染色切片上，芽生菌呈圆形，棕褐色（图1A）；PAS染色，细胞核蓝色，芽生菌菌壁呈红色（图1B）；六胺银染色显示芽生菌菌壁呈黑色，背景为红色（图1C）；抗酸染色显示细胞核蓝色，个别数量芽生菌菌壁呈红色，大多数菌壁不着色（图1D）；爱尔新蓝染色（pH2.5）显示细胞核红色，芽生菌菌壁不着色（图1E）。

讨 论

显示真菌的染色方法很多，常用的有爱尔新蓝染色（pH2.5）法、抗酸染色法、PAS染色法和六胺银染色法。在这几项显示真菌的染色方法中， 寻找一种特异性高，操作简便的方法显示芽生菌至关重要。

显示芽生菌，需要与隐球菌相鉴别，爱尔新蓝染色（pH2.5）是显示隐球菌的一种特异的方法，隐球菌爱尔新蓝染色阳性，菌壁呈蓝色，芽生菌爱尔新蓝染色阴性，菌壁不着色。抗酸染色菌体壁多数阴性，少数个别菌体壁红色，此方法特异性低，不能很好地把芽生菌显示出来。PASM染色可以显示芽生菌，但是从方法学上说，PASM整体实验过程过于繁琐，它需要于恒温箱60℃加热40~60min，染色反应时间总体偏长，提高温度缩短反应时间也不易控制，且反应容易有银离子沉淀析出，往往导致背景较深。从菌体显示效果上分析，芽生菌的硬核小体圆形，厚壁，个别有分隔，PASM显示芽生菌菌体分隔现象不明显，过染还会使菌体成黑色实心圆球状。为了让菌体的厚壁及分隔现象能够清晰地显示出来，我们对传统的PAS染色方法进行了改良，我们首先用0.5%的高碘酸氧化15min后，再用8%铬酸氧化15min，不同试剂双重氧化后得出的阳性结果更佳清晰，个别菌体容易观察到明显的分隔。传统的PAS染色用时差异也较大，无色品红放置时间的长短不同，实验室温度的高低不同，实验反应的时间也是不同的，如夏季温度高时无色品红着染20min，冬季温度低时无色品红着染40min左右，这些种种因素都导致PAS整体实验反应时间的不确定性。我们经过一系列的实验，长期摸索，把水浴箱温度调整为42℃，玻片在无色品红中反应5~7min，芽生菌的阳性结果定位清晰，菌壁四周深红，个别菌体容易观察到明显的分隔，背景干净最佳。

本实验比较了4种特殊染色方法用于观察病理组织中的芽生菌，结果显示改良PAS染色法是检测芽生菌的最佳染色方法，此方法着染的芽生菌菌壁最清晰，最容易辨认，菌体分隔现象容易观察，值得在临床病理工作中广泛使用，我们在实际工作中可根据实际需要选用适合本实验室的方法。