基于虚拟仿真技术的细胞凋亡流式检测线上线下混合式教学改革实践

陈瑾，秦霞，黄慧，许健

（浙江中医药大学医学技术与信息工程学院，杭州 310053）

细胞凋亡是在正常生理或病理状态下发生的一种自发的、程序化的死亡过程，其受一系列基因、蛋白的严密调控，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。细胞凋亡异常与肿瘤、神经退行性疾病等的发生发展密切相关[1]，准确地对细胞凋亡进行检测是细胞化学研究的重要技术手段。目前在细胞凋亡形态学观察的基础上，生物化学、分子生物学和免疫学等技术均已广泛应用于细胞凋亡的检测[2]。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）因其快速、准确、多参数，并能对单个细胞逐一检测的特征，在凋亡检测中占据重要地位，其中基于凋亡细胞表面磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl-serine, PS）外翻特征的Annexin V-FITC/PI 双染法操作简便、重复性好，是目前最常用的细胞凋亡检测方法[3]，许多高校加强了对该技术的教学重视。然而流式细胞仪为高精密度、复杂贵重仪器，高校实验场地局限、仪器缺乏，教学还处于基本理论知识普及和基础操作示教阶段，学生仅在课堂上认识和了解仪器结构和原理，却难以达到理论与应用融会贯通[4]。

虚拟仿真实验通过计算机模拟并创建三维动态视景和行为实体，将学习人员置于模拟实验环境中操作学习，并完成各种实验项目。利用虚拟仿真技术沉浸性、交互性和构想性特征，全数字建模仿真，虚拟空间情景漫游，解决了课堂中复杂仪器技术艰深难懂的教学难点，提升学生的动手操作能力，在节约大型仪器投入的基础上，让学生熟悉仪器原理与操作环节，成为“互联网+”实践教学改革的新起点[5]。但虚拟仿真操作程序是一套既定的流程，无法完全预测学生在真实操作过程中可能遇到的突发状况，不利于学生应变能力、分析问题和解决问题的能力培养[6]。因此传统的线下教学与孤立的线上教学都难以取得最佳学习效果。

混合式教学即线上学习和面授学习的混合，是在“互联网+”背景下，现代信息技术与教学过程深度融合的产物。混合式教学模式以满足学生个性化、智能化、信息化、定制化的学习需求为目标，实现翻转课堂，达成线上新知学习和线下知识内化的完美结合[7]。针对“互联网+”时代下混合式教学的学习理论、教法学基础、方法论等已有系列研究[8,9]。混合式学习用建构主义理论解释个性化知识的习得，用联通主义理论解释创造性知识的生成，促使教师由学科专家、知识传授者转变为学习设计者和学习促进者。

因此，本文以细胞凋亡的流式检测为例，着力构建线上线下联动教学，以线上虚拟仿真操作为主，掌握实验原理、仪器结构和基本操作，培养学生自主学习能力；辅以线下重点示教，解读凋亡流式检测过程中的注意事项和问题分析，提升学生综合实践能力。

1 教学目标

知识目标：通过线上虚拟演练、线下示教，学生掌握细胞凋亡流式检测的基本原理、操作与技术要求，并掌握Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡双染法流式检测结果的解读。

能力目标：在线上虚拟仿真操作中，培养学生自主学习，发现问题、分析问题的能力，锻炼独立探索精神，结合线下重点示教、疑难解答，加强团队合作意识，提升解决问题的能力。

2 教学理念与方法

在教学中，采用“建构主义”教学思想[10]，最直接的体现就是以学生为中心，根据学生的不同状况实施相应的教学，实现因材施教，由传统的知识归纳、逻辑演绎式的讲解转变为创设情境、协作学习、自主学习，真正动手操作实验，成为知识的探索者和学习认知主体。采用线上线下虚实结合教学法（图1）。

图1 线上线下虚实结合教学示意图Fig. 1 Schematic diagram of the online and offline mixed teaching mode

2.1 虚拟教学法

通过虚拟仿真技术在线还原流式细胞凋亡检测的真实场景，完成细胞样本准备、流式细胞仪调试、检测方案建立、数据采集与结果分析等在线虚拟操作，让学生在虚拟实验中掌握流式凋亡检测原理、操作方法和注意事项等知识点。

2.2 现实教学法

虚拟仿真实验按既定标准流程设置，针对实验中可能出现的问题不能很好示范教学，因此在课堂教学中辅以样品前处理操作和流式细胞仪检测示教，重点指出流式凋亡检测注意事项。

样本制备：流式样本要求单细胞悬液，样本制备好坏直接影响检测结果，在本实验中采用Raw264.7细胞为贴壁细胞，在收集细胞悬液过程更要注意消化过程对细胞活力影响。

仪器调试：流式的复杂在于其参数的设置，在检测过程中，考虑流式细胞仪阈值、电压、补偿、圈门不合理对结果的影响。

上述注意点在虚拟仿真实验中无法细致展示，通过课堂教学弥补，达到以虚促实，虚实结合的教学目的，同时培养学生发发现问题，分析问题，解决问题的能力。

3 教学过程实施

3.1 视频演示自学

课程首先通过细胞凋亡和流式细胞术动画演示视频，引导学生主动学习掌握细胞凋亡和流式细胞术的基本概念、原理、检测步骤等，达到知识目标。本实验采用Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡，其原理是凋亡早期细胞表面的磷脂酰丝氨酸由细胞膜脂质双层内层转移到外层，其对FITC标记的Annexin V具有高度亲和力，显示绿色荧光；PI不能通过细胞膜，只有当细胞处于晚期凋亡和坏死状态，细胞膜受损时，PI可进入细胞内并嵌入DNA双链显示红色荧光[11]。而流式细胞仪可对经过特异荧光素染色的单细胞悬液样品进行逐一检测，样本被特定波长的激光束照射，细胞表面的荧光素产生荧光，同时产生光散射，这些混合的光信号经光电倍增管和光电二极管转变为电子信号，并经过模数转换器以电子脉冲的形式被计算机系统接收并分析得出细胞的生物学特征[12]。因此将Annexin V-FITC与PI联用，在488nm激光器照射下，根据产生的荧光信号，Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞；Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞；Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞；Annexin-V阴性-PI阳性，代表坏死细胞。学生通过线上自主学习后，在微助教上完成前测知识答题，评价自学情况。这一过程一方面有助于让学生对照实验目标找出学习薄弱环节，针对易错点，课堂上重点阐述；另一方面可以激活先备知识，将相关的细胞化学、分子生物学、仪器分析等知识点串联起来，逐步建立知识体系。

3.2 线上虚拟仿真教学

学生在线完成细胞凋亡流式检测模拟演练。首先是样本制备，包括获得暴露后的单细胞悬液、Annexin-V-FITC孵育、洗涤离心后PI孵育。随后模拟操作流式细胞仪开机质控，掌握流式检测技术的基本操作及仪器性能评价。质控通过后，方可开始检测。进入虚拟仿真实验练习环节，每一操作步骤均设置了说明，指导学生完成实验方案建立，上样、数据采集、结果解读（图2）。在关键步骤设置提问，如在流式细胞仪调试中，判读质控结果，包括变异系数（coefficient of variation, CV）和荧光强度均值（mean fluorescence intensity, MFI）；在细胞凋亡检测中涉及多色荧光，注意荧光补偿的正确调节，系统实现实验过程智能指导，学生与线上教师进行互动提问与答疑，教师掌握每一位学生的线上学习状态。系统具有错误提示和自动评价的功能，学生通过人机交互的方式，实现边练习、边学习、边调整，错误和不足之处及时得到改正和补充，增强体验感和互动趣味性。

图2 细胞凋亡流式检测线上虚拟仿真演练流程Fig. 2 Operation stream of the online virtual simulation of cell apoptosis detection by flow cytometry

3.3 线下实操演示

在课堂实验教学中，因课时限制，凋亡样本由教师提前制备好，进行流式细胞仪上机检测演示，在此过程中强调流式细胞仪凋亡检测的注意事项，如消化处理产生的死细胞及细胞碎片在流式结果中的判断，从而提示学生回忆样本制备虚拟操作过程中细胞消化时间、离心条件设置等注意点，学会合格样本的判断；又如在补偿调节环节，无补偿和有补偿情形下，各群细胞的分布，学生直观领悟参数合理设置的重要性。最后针对流式应用中，学生普遍反映的难点—流式图谱解读进行重点讲述（图3）。根据凋亡检测结果，阐述流式图谱横纵坐标参数类型，结合视频中流式采集信号原理，理解不同参数代表的信号类型、不同群体细胞揭示的生物学含义，充分调动学生积极思考，能举一反三，真正学以致用。

在本实验中，首先通过散射光信号，包括前向角散射光和侧向角散射光，圈出目的细胞群，调节仪器阈值排除碎片干扰；随后根据FITC单标管和PI单标管调节荧光补偿；最后在Annexin-V-FITC和PI双参数散点图中，设置十字门，分析各象限细胞群含义及比例（图3）。象限左下为双阴性群为活细胞的比例，象限右下为Annexin-V-FITC单阳细胞群为凋亡早期细胞的比例，象限右上为双阳性群为凋亡晚期细胞的比例，象限左上为PI单阳性群为坏死细胞群比例。

图3 细胞凋亡流式检测结果解读。A，空白管；B ，FITC单标管；C， PI单标管；D 双标管Fig. 3 Interpretation of the flow cytometry results of cell apoptosis. A, blank tube; B, FITC single stained tube; C, PI single stained tube; D, FITC and PI double stained tube

3.4 课后拓展

课程结束后，选取以往凋亡检测中出现的几种异常结果进行案例讨论，思考实验中出现的问题以及解决方案，如有的样本结果PI单染细胞比例较高，提示有较多坏死细胞，可能的原因是什么？判断荧光补偿不足与过度？最后结合理论介绍的细胞凋亡检测方法，形态变化、DNA断裂检测、线粒体膜电位变化等，比较各方法特点，引导学生实现知识的进一步内化，充分理解凋亡进程。

4 教学效果评价

基于虚拟仿真技术的细胞凋亡流式检测线上线下混合式教学改革，形成了“多层次、多形式、多内容”的立体化实验教学体系。通过课堂前测、后测及虚拟仿真考核模块，构建双线考核评价和教学质量监控体系，切实提高学生学习成效。虚拟仿真系统通过人机对话模式，实行实时考核方式，系统将根据学生在考核中的表现给出系统评价和具体的数据分析，通过可视化图形方式直观体现学生操作过程中正确、错误及未完成步骤，并给予正确的前10%学生奖励分（图4A），既调动学生积极性，又能及时对薄弱的部分进行强化改进，真正实现过程中全方位评价，并使考核、效果评估进一步规范化与标准化。课堂评测注重理论知识点的掌握，虚拟仿真考核模块侧重学生观察能力、思维能力和操作能力，两者相互补充。课后对课堂满意度及学习效果开展问卷调查（图4B），对教学设计、虚拟仿真演练、课后拓展及考核形式的满意度分别为82.1%、68.2%、88.3%和70.4%，其中对于虚拟仿真演练主要存在问题是软件操作界面友好性，有待后续进一步进行技术改进。在学习效果方面，混合式教学对学生学习兴趣、探索精神、实践能力、自主学习能力和分析解决问题能力均有明显提升（图4C）。

图4 教学效果评价Fig. 4 Evaluation of the teaching effect

5 讨论

传统的细胞凋亡实验教学以实体课堂为教学形态，学校、教材和教师主导着教学的整个过程，学生学习受到时空和资源等方面条件限制，凋亡检测多采用形态观察，与目前研究中的先进检测技术脱节。虚拟仿真技术有效规避高校实验室硬件环境不足的限制，可促进细胞化学教学体系的完善。虚拟仿真项目已成为混合式教学中优质在线资源的重要组成部分，本实验依托流式细胞仪凋亡检测虚拟仿真项目，开展线上线下混合式教学改革。线上虚拟演练，其无时间、空间限制的“游戏式”网络学习，提高了学生学习兴趣，培养自主学习能力；线下重点示教，加深理论知识的内化，将课堂教学中理论讲解的深刻特点与虚拟仿真实践操作中高度灵活的自由特点相结合，形成混合式教学模式，更有助于提升教学效果[13]。

在教学过程及反馈中也发现了一些问题：首先，线上自学过程依赖学生自觉性及领悟性，存在学生个体差异，对线下的重点示教造成一定难度，后续将进一步加强线上学习的过程管理，开展个性化指导，补齐短板；其次，对于虚拟仿真演练，鼠标的点击与实际动手操作存在差异，无法完全预测学生在真实操作过程中可能遇到的突发状况，尤其在流式参数设置中，随样本状态需不断调整，但针对大型仪器课堂教学无法满足人人都有操作机会，因此鼓励学生课外多参与学科竞赛，让科研反哺教学，提升学生创新能力。