高效液相色谱-二极管阵列法同时测定酱腌菜中5 种甜味剂

田 毅 刘 畅 盛 静 杨怡乐

（重庆市黔江食品药品检验所，重庆黔江 409000）

酱腌菜是我国广大消费者比较喜爱的食品之一，为保持蔬菜的营养价值，增强蔬菜口感，延长保质期，常在生产过程中添加各种食品添加剂，包括防腐剂和甜味剂。甜味剂按其来源可分为人工合成甜味剂和天然甜味剂。人工合成甜味剂由于在人体内不进行代谢吸收，不提供热量且甜度高，越来越受到人们的重视。糖精钠、安赛蜜、纽甜、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖等均为人工合成甜味剂。甜味剂被广泛应用于食品行业，但添加过量具有一定毒副作用，食用后会危害人体健康，因此在GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、纽甜等甜味剂在酱腌菜中的使用限量和适用范围都做了明确的规定。

目前，国标方法最多可同时检测酱腌菜中2 种人工合成甜味剂，且样品前处理方法、净化步骤、流动相条件、检测器类型等均有区别。文献报道的甜味剂同时检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱法；吴晓红，李小华等的研究中仅对糖精钠和安赛蜜进行检测，该方法无法实现酱腌菜中多种甜味剂的同时检测，而在实际风险监测工作中有时需要同时检测多种甜味剂。如果分别对几种甜味剂进行检测，不仅费时费力，而且检测效率也低。因此，在此基础上，本文建立了一种采用高效液相色谱-二极管阵列同时检测酱腌菜中多种甜味剂的测定方法，经验证该方法高效快捷、准确可靠、操作性强，能较好的适用于日常检测工作。

1 材料和方法

1.1 试剂、仪器

甲醇、乙腈，均为色谱纯；甲酸、乙酸锌、亚铁氰化钾，均为分析纯；安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜对照品，含量均≥97%；超纯水。

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配DAD 检测器；TG16-WS 台式高速离心机；IKA MS3 digital 涡旋仪；电子天平；ELGA 超纯水系统。

1.2 色谱条件

流动相：A 为0.02 mol/L 乙酸铵溶液；B 为乙腈，采用梯度洗脱，梯度洗脱程度见表1。

表1 流动相及流速

色谱柱：岛津C18柱（4.6 mm×250 mm；5 μm）；柱温：30 ℃，进样量：10 μL，流速：1.0 mL/min，检测波长：210 nm。

1.3 标准溶液制备

1.3.1 标准储备溶液制备

准确称取适量糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜标准物质于10 mL 量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合标准储备溶液。

1.3.2 混合标准使用溶液制备

将配制好的标准储备溶液配制成质量浓度为50 μg/mL的混合标准使用溶液；用超纯水逐级稀释成质量浓度为1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的混合标准系列工作溶液，待用。

1.4 供试品溶液制备

1.4.1 提取

称取1.0 g 混合均匀试样于50 mL 离心管中，加入10 mL 0.15%甲酸水溶液超声提取15 min，加入亚铁氰化钾和乙酸锌各2 mL，涡旋振摇2 min，5 000 r/min 离心5 min，上清液转移至25 mL 容量瓶中，再提取一次，合并上清液，定容，摇匀静置，上清液过孔径0.45 μm 微孔滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器在190 nm～400 nm 范围内对5 种甜味剂进行光谱扫描，结果显示5 种甜味剂的最大吸收波长分别为：纽甜218 nm，阿斯巴甜200 nm，阿力甜200 nm，糖精钠230 nm，安赛蜜230 nm。综合5 种甜味剂的最大吸收波长，分别选取205 nm、210 nm、220 nm、230 nm 波长进行测定。结果表明，在210 nm 时，5 种甜味剂峰响应值高，基线平稳度好。因此，本试验选择210 nm 作为5 种甜味剂的检测波长。5 种甜味剂混合标准品色谱图如图1 所示。

图1 210 nm 处5 种甜味剂的混合标准品色谱图

2.2 前处理的对比选择

本试验对比了2 种前处理方式：一种是试样经提取溶液提取，蛋白沉淀，离心后过滤膜直接上机；另一种是样品经提取溶液提取，蛋白沉淀，离心，静置后取适量供试品溶液过固相萃取柱（C18，HLB），溶剂复溶后过滤膜上机。结果表明，试样过HLB 固相萃取柱后基线平稳，杂峰较少，但安赛蜜低水平加标时回收率低于70%；而经C18固相萃取柱后，糖精钠、安赛蜜回收率均未达到60%，过净化柱的前处理方式回收率不能取得较好效果；而样品直接提取后上机的处理方式，取得较好效果，通过加标回收验证，5 种甜味剂均能达到85%以上，样品基质干扰少，重现性较好。

2.3 色谱条件的优化

本试验考察了甲醇-水、甲醇-乙酸铵、乙腈-乙酸铵等体系对5 种甜味剂的分离效果影响，结果表明，采用甲醇-水体系作为流动相时，随着甲醇体积分数从5%上升至75%，5 种甜味剂出现峰拖尾严重，峰形变宽现象；在甲醇-乙酸铵体系中，由于甲醇的洗脱能力较弱，当甲醇含量较低时，阿斯巴甜和纽甜出峰时间较晚，影响检测时间，不利于快速检测。通过对比优化，最终选择乙腈-乙酸铵体系作为流动相，进行梯度洗脱，设定流速1 mL/min，柱温30 ℃时，可以使5种甜味剂之间得到较好分离，且不会受到样品基质干扰。

2.4 方法回收率和精密度

分别将5 种甜味剂混合标准溶液以低中高3 个浓度水平（5 μg/g、10 μg/g、20 μg/g）添加到酱腌菜试样中，进行3 个水平加标回收试验，重复测定6次，同1.4 样品处理后上机测定，结果见表2。

由表2 可知，样品的平均加标回收率在88.5%～103.2%，相对标准偏差小于3.5%，表明该方法精密度和重现性均能满足分析要求。

表2 5 种甜味剂的平均加标回收率试验及相对标准偏差（n=6）

2.5 标准曲线及检出限

将1.3.2 中配制好的混合标准系列工作溶液按照要求上机测定。以保留时间和光谱进行定性，峰面积进行外标法定量，5 种甜味剂在质量浓度1 μg/mL～50 μg/mL 范围内线性关系良好，根据S/N=3 计算检出限，结果如表3 所示。由表3 可知，方法检出限（LOD）为：0.6 mg/kg～4.5 mg/kg，定量限（LOD）为：2.3 mg/kg～14.0 mg/kg。

表3 线性范围、相关系数及检出限

2.6 市场抽样检测结果

采用本方法对100 批市售酱腌菜试样进行检测。结果发现，11 批酱腌菜中检测出糖精钠，其检出值范围为9.45 mg/kg～19.7 mg/kg，14 批酱腌菜中检出安赛蜜，其检出值范围为5.36 mg/kg～15.37 mg/kg，4 批酱腌菜中检出2～3 种甜味剂，这表明酱腌菜中复合使用甜味剂的情况存在，但其检出值均在国标限定范围内，表明企业都能按照规定要求使用甜味剂。

3 结论

本文建立了高效液相色谱-二极管阵列法同时测定酱腌菜中5 种甜味剂含量的方法，与传统方法相比，该方法前处理简单，操作快捷，且该方法回收率、检出限、定量限等均能满足定量分析要求，可同时测定酱腌菜中5 种甜味剂，可为酱腌菜的质量安全监管提供技术支撑。