蜂王浆冻干粉对2型糖尿病小鼠糖脂代谢、胰岛素抵抗及血清炎症因子的影响*

王春梅 刘晋佳 姜玉锁*

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷 030801）

2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）是一种以高血糖和胰岛素抵抗为特征的异质性代谢紊乱的慢性疾病。据最新国际糖尿病联盟（IDF）发布的全球糖尿病地图（第9 版）显示，全球糖尿病患病人数不断上升。目前全球约有4.63 亿20～79 岁成人患糖尿病，预计到2045 年，糖尿病患者会达到7.002 亿。而中国糖尿病患者约有1.164 亿人，位居世界第一。T2DM 的发生与发展与许多因素有关，其中糖或脂质摄入过多以及遗传因素极大可能地促进T2DM 的发生。炎症、血糖和血脂异常是T2DM患者心血管疾病的已知危险因素。

尽管二甲双胍是目前国际上公认的临床首选降糖药物，但服用后会出现食欲减退、恶心呕吐、大便稀薄与腹泻等一些毒副作用。因此，有必要寻找一种安全、有效的替代剂，例如饮食成分作为辅助治疗，更好地预防T2DM 发生及缓解其病程发展。蜂王浆（Royal jelly）是适龄工蜂咽下腺（Subpharyngeal gland）和上颚腺（Mandibular gland）分泌出来的乳浆状物质，呈淡黄色或乳白色。蜂王浆含有丰富的氨基酸、维生素、微量元素、活性酶等营养物质，是一种理想的天然调节剂和营养滋补剂，现已被广泛地应用于人体保健、疾病治疗等多方面。现代药理学研究表明，蜂王浆具有抗氧化、抗病毒、抗炎、促进伤口愈合和调节神经系统等作用，其主要功效成分10-羟基-2-癸烯酸（10-H2DA）是迄今为止发现仅在蜂王浆中天然存在且含量最高的有机酸，被称为王浆酸。早期生物学研究发现，蜂王浆中具有类胰岛素活性物质，并通过临床试验证明该物质可调节健康人体的葡萄糖代谢。Chen 等通过RAW264.7 炎症细胞模型，发现蜂王浆中存在3 种主要脂肪酸：反式-10-羟基-2-癸烯酸（10-H2DA）、10-羟基癸烯酸（10-HDAA）和癸二酸（SEA），这3 种脂肪酸对主要炎症介质一氧化氮和白细胞介素-10 的释放具有有效的剂量依赖性抑制作用。此外，Khoshpey 等通过临床试验发现蜂王浆能改善载脂蛋白A-1 及载脂蛋白B 和载脂蛋白A-1 的比率，从而降低糖尿病患者患心血管病的几率。这为进一步探讨蜂王浆冻干粉对T2DM 的降糖、调节血脂及抗炎症作用提供了理论依据。本试验以高脂饮食联合低剂量STZ 诱导的T2DM小鼠为模型，研究蜂王浆冻干粉对T2DM的治疗作用，为蜂王浆的进一步开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与药物

蜂王浆冻干粉，10-HDA≥4.0%，神蜂科技开发有限公司（注：蜂王浆冻干粉的成人推荐治疗剂量为12 g/d～15 g/d，相当于200 mg/kg·bw～250 mg/kg·bw，因此，本试验选取80 mg/kg·bw、240 mg/kg·bw、400 mg/kg·bw3 个剂量对T2DM 小鼠进行干预）；链脲佐菌素（STZ），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）检测试剂盒，北京中生北控股份有限公司；空腹胰岛素（FINS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介细胞素-6（IL-6）检测试剂盒，北京华英生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠（CMC），北京索莱宝科技有限公司；Co60 辐照维持饲料，斯贝福（北京）生物技术有限公司；高脂饲料，D12492，美国Research Diets 公司；柠檬酸钠缓冲液，pH=4.5，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

TW423L 电子天平，日本岛津国际贸易有限公司；5427R 高速冷冻离心机，艾本德中国有限公司；BS-420 迈瑞全自动生化仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；DR-200BS 华卫德朗酶标分析仪，无锡华卫德朗仪器有限公司；GA-3 血糖仪及配套试纸，三诺生物传感股份有限公司；其余设备均为实验室常用仪器。

1.2 方法

1.2.1 T2DM模型建立及分组给药

SPF 级雄性BALB/c 小鼠，4～6 周龄，购自山西医科大学实验动物中心。所有小鼠均严格遵循国际动物实验规则和国际公认的实验室动物使用和护理伦理原则。小鼠饲养在设施通风良好，环境温度为（24±2）℃，相对湿度为50%～60%的动物室内，按12 h 光照/黑暗周期饲养，并进行自由采食与饮水。Co60 辐照维持饲料由4%脂肪，55%碳水化合物、18%蛋白质组成，高脂饲料（D12492）由24.9%脂肪，26.3%碳水化合物、26.2%蛋白质组成。

适应性饲养一周后，按体重随机选取10 只小鼠作为普通维持饲料饲喂的正常组（CON），其余小鼠则以高脂饮食（High-fat diet，HFD）D12492进行饲喂。饲喂4 周后，禁食过夜，高脂饮食的小鼠连续5 d 低剂量腹腔注射STZ（40 mg/kg·bw，溶于0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液）；CON 组小鼠注射等容量柠檬酸钠缓冲溶液。一周后，禁食过夜，用血糖仪测量小鼠尾静脉的空腹血糖水平，其中模型小鼠空腹血糖值高于11.1 mmol/L 的为T2DM小鼠。选取40 只体重和血糖程度相似的T2DM 小鼠随机分为4 组：蜂王浆冻干粉低剂量组（RJP-L，80 mg/kg·bw）、蜂王浆冻干粉中剂量组（RJP-M，240 mg/kg·bw）、蜂王浆冻干粉高剂量组（RJP-H，400 mg/kg·bw）和模型组（T2DM）。T2DM 组与CON 组小鼠以等容量羧甲基纤维素钠（CMC）进行灌胃，每日灌胃给药一次，连续4 周。给药期间所有小鼠均饲喂Co60 辐照维持饲料。观察并记录各组小鼠生长情况。

1.2.2 血糖水平测定

分别于第0 d、7 d、14 d、21 d、28 d 给药后，禁食过夜，通过剪尾取血，用血糖仪测定小鼠空腹血糖值（FBG）。

1.2.3 口服葡萄糖耐糖试验（OGTT）

各组小鼠在干预28 d 后，禁食过夜，进行OGTT。给所有小鼠口服葡萄糖溶液（2 g/kg），随后使用血糖仪分别在0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 从尾尖取血进行血糖水平测定。

1.2.4 血液生化指标测定

OGTT 完成后，从小鼠眼眶后静脉丛采血并分离血清，使用迈瑞BS-420 全自动生化仪测定血清中TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平。同时使用华卫德朗DR-200BS 酶标分析仪通过酶免法分析血清中TNF-α、IL-6、FINS 水平。根据公式：空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（μU/mL）/22.5，进行胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计软件对实验数据进行单因素方差分析和LSD 多重比较。所有数据均以平均值±标准差（Mean±SD）表示，P＜0.05 表示有显著差异，P＜0.01 表示有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 RJP 对T2DM 小鼠血糖及耐糖量的影响

RJP 对T2DM 小鼠空腹血糖及耐糖量的影响结果见表1。

如表1 所示，在整个试验期间，与CON 组小鼠相比，T2DM 组一直处于较高FBG 水平（P＜0.01），且血糖水平稳定。T2DM 组与3 个RJP 干预组的初始FBG 水平相似（P＞0.05），均显著高于CON 组（P＜0.01）；与T2DM 组相比，在干预的第28 d，RJP-L 组可显著降低FBG 水平（P＜0.05），在干预的第21 d 和28 d，RJP-M 组可显著降低FBG 水平（P＜0.05，P＜0.05），在干预的第14 d、21 d 和28 d，RJP-H 组显著降低了FBG 水平（P＜0.05）。试验结果表明，RJP 具有显著的降血糖作用。

表1 RJP 对T2DM 小鼠空腹血糖水平的影响

RJP 对T2DM小鼠糖耐量的影响结果见下页表2。

表2 RJP 对T2DM 小鼠糖耐量的影响

由表2 可知，在OGTT 中，T2DM 组在0 min、30 min、60 min、90 min 和120 min 的血糖水平均显著高于CON 组（P＜0.01）。但与T2DM 组相比，RJP-M 分别在0 min、30 min、60 min 和90 min 显著降低了血糖水平（P＜0.05，P＜0.01），RJP-H 组则分别在30 min 和60 min 显著降低了血糖水平，而RJP-L 组在各个时间点血糖水平均低于T2DM组但差异不显著（P＞0.05）。说明RJP 可显著提高T2DM小鼠的葡萄糖耐受能力。

2.2 RJP 对T2DM 小鼠脂代谢的影响

RJP 对T2DM小鼠脂代谢的影响结果见表3。

表3 RJP 对T2DM 小鼠TC、TG、LDL-C 及HDL-C 的影响

由表3 可知，28 d 干预期结束后，与CON 组小鼠相比，T2DM组小鼠的血清TG 水平显著升高，HDL-C 水平显著下降（P＜0.01），TC、LDL-C 水平无显著差异（P＞0.05）。经RJP 给药后，RJP-L组TG 水平显著降低（P＜0.05），且3 个RJP 干预组都能显著提高HDL-C 水平（P＜0.01），而对TC和LDL-C 水平无显著影响（P＞0.05），说明RJP 对糖尿病所致的TG 和HDL-C 紊乱具有调节作用。

2.3 RJP 对T2DM 小鼠胰岛素抵抗的影响

RJP 对T2DM小鼠胰岛素抵抗的影响结果见表4。

由表4 可知，与CON 组相比，T2DM 组的FINS 和HOMA-IR 水平显著升高（P＜0.01）。经RJP 干预后，与T2DM组相比，RJP-M组与RJP-H组显著降低了HOMA-IR 水平（P＜0.05），而各RJP 干预组的FINS 水平均下降，但无显著性差异（P＞0.05），说明RJP 能增加胰岛素的敏感性、降低胰岛素抵抗。

表4 RJP 对T2DM 小鼠FINS 和HOMA-IR 的影响

2.4 RJP 对T2DM 小鼠炎症因子的影响

RJP 对T2DM 小鼠炎症因子的影响结果如表5所示。

表5 RJP 对T2DM 小鼠TNF-α 和IL-6 的影响

由表5 可知，与CON 组相比，T2DM组血清中IL-6、TNF-α 水平显著升高（P＜0.01），而3 个RJP 干预组均可显著降低血清中IL-6、TNF-α 的水平（P＜0.01），说明RJP 能降低IL-6、TNF-α的水平，进而延缓T2DM病程发展。

3 讨论

本试验在高脂饮食的基础上，通过多次低剂量STZ 诱导，得到具有T2DM 典型特征的小鼠模型，其糖脂代谢异常、葡萄糖耐受能力降低、高胰岛素血症以及胰岛素敏感性降低，并且血清中炎症因子TNF-α、IL-6 水平显著升高。

T2DM 是一种以高血糖、胰岛素缺乏和胰岛素抵抗为特点的慢性疾病，严重影响着患者的生命健康及生活质量。试验中T2DM小鼠的血糖水平异常升高，并在试验期结束时达到了最高值，经RJP 干预结束后，3 个RJP 干预组血糖水平均显著下降，且RJP-H 组效果最好，但仍未恢复到正常小鼠FBG 水平，这可能与干预周期太短有关。葡萄糖耐量降低意味着体内糖代谢的某一个或数个环节发生障碍，因此糖耐量是评价药物药效的一个重要手段。OGTT 试验结果表明，T2DM 组的血糖值在各个时间点均显著高于CON 组，说明其葡萄糖耐受能力大大降低，经RJP 干预后，RJP-M 组与RJP-H 组能显著提高葡萄糖的耐受能力。胰岛素抵抗是T2DM 的主要特征，贯穿着病情发展的始终。试验结果表明，与CON 组相比，T2DM组小鼠血清FINS 水平及HOMA-IR 显著升高，说明该模型具有高胰岛素及胰岛素抵抗的特征，给予RJP 后RJP-M组及RJP-H 组显著降低了HOMA-IR 水平这与文献中报道的蜂王浆能降低血糖，改善胰岛素抵抗的结果是相符的。

脂质代谢紊乱是T2DM又一重要特征，而脂质代谢异常又进一步加重糖代谢紊乱，二者互为因果关系。TC、TG、HDL-C、LDL-C 是反应T2DM 血脂情况的关键指标，其中TC、TG 异常患者发生糖尿病、各类肝病及心血管动脉硬化的风险较大。同时，已有研究表明，在T2DM 中，患者血液中HDL-C 降低或LDL-C 的升高，导致HDL-C 无法抑制LDL-C 与血管壁弹性成分结合及内皮细胞对LDL-C 摄取，从而减弱了内皮细胞的保护作用，最终引起血管粥样硬化的发生。本试验T2DM组中的TG、HDL-C 水平均低于CON 组，RJP 干预后RJP-L 组TG 水平有所下降，而各RJP 干预组的HDL-C 水平有所上升，可见RJP 在机体内对脂代谢紊乱有良好的调节作用。

另外，TNF-α 和IL-6 等多种炎症因子与胰岛素抵抗、T2DM存在密切联系。TNF-α 作为机体炎症反应过程中最早出现的炎症因子，在糖蛋白的信号传导与合成中扮演着重要角色，糖耐量异常患者TNF-α 水平明显升高；IL-6 能够抑制机体中胰岛素受体的信号转导并降低胰岛素敏感性。当TNF-α、IL-6 等炎症因子及炎性细胞在局部血管内皮中积累时，便可引起内屏功能障碍，进而引发糖尿病并发症。本研究结果显示，高脂饮食联合STZ 诱导的T2DM 小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α 水平明显升高，而使用RJP 干预后，小鼠血清中IL-6、TNF-α 水平在各剂量干预组中明显降低，提示RJP 干预能有效的抑制T2DM小鼠机体的炎症反应，这与Kunpyo 的研究结果相似。Kunpyo 等通过脂多糖刺激诱导的腹腔巨噬细胞炎症模型发现，蜂王浆具有抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、NO 的产生和NF-κB 活性，具有抗炎作用。

4 结论

综上所述，蜂王浆冻干粉不仅能显著降低血糖、血脂，还能通过调节TNF-α、IL-6 炎症因子进一步改善胰岛素抵抗，具有一定的临床应用价值并且有望成为辅助治疗T2DM的功能食品。但本试验只是对蜂王浆冻干粉进行了研究，尚不明确蜂王浆抗T2DM 作用的有效活性成分，故对蜂王浆抗T2DM 作用机制进行多靶点深层次研究，以及筛选出有效活性成分是日后研究重点。