沾3区块内源微生物好氧和厌氧激活特征

李金志,冯 云,林军章,谭晓明,王 静,吴晓玲

(1.中国石油化工集团有限公司 胜利油田分公司 油气开发管理中心,山东 东营 257000; 2.中国石油化工集团有限公司 胜利油田分公司 石油工程技术研究院,山东 东营 257000)

微生物提高原油采收率(MEOR)是继热力驱、化学驱、聚合物驱等传统方法之后的一项极具潜力的新技术。MEOR技术具有适用范围广、工艺简单、投资少和无污染等优点,已经在许多国家的石油开采应用中获得了明显的增产效果,是目前最有发展前景的采油技术之一[1-4]。

经过一段时间注水开发的油藏,在数量和结构上形成相对稳定的内源微生物生态系统。内源微生物采油工艺是指由注水井注入激活剂,利用内源微生物在油藏中的代谢活动及代谢产物(生物表面活性剂、酸、有机溶剂和生物气),与岩石/油/水界面产生相互作用,降低界面张力,降低原油黏度,从而提高原油采收率[5-10]。内源微生物激活过程大致包括好氧和厌氧两个阶段[11-12]。油藏深部绝大部分是厌氧环境,尽管在微生物采油工艺实施过程中配注空气进入油藏,但空气中的O2在油藏前端很快就被注水井附近的还原性物质和好氧微生物消耗掉,油藏中绝大部分进行的是厌氧微生物代谢,而且厌氧微生物代谢集中在油藏中后部剩余油富集的区域,所以如何激活和调控厌氧微生物代谢在微生物采油过程中的驱油作用是技术关键[13-14]。目前的研究大多集中在好氧激活调控方面,对于微生物厌氧激活的限制因素与调控手段的研究较少[15-18]。李彩风等[19]以地芽孢杆菌(Geobacillus)为研究对象,通过适宜的激活剂体系能选择性激活该类细菌,乳化指数能达到98%。王志荣等[20]研究得到菌株Serratiasp. SCH-1在好氧条件下的乳化剂产率为0.75 g/L。文献[19-20]未考察厌氧条件下乳化能力。Chayabutra等[21]研究了铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 10145可以通过硝酸盐呼吸在缺氧条件下合成鼠李糖脂表面活性剂。目前已报道的能够厌氧产乳化剂的菌种和代谢调控研究比较缺乏,因此调控油藏微生物实现高效的厌氧代谢对微生物驱油效率的提高具有重要意义[22]。本文以胜利油田沾3区块油井产出液的内源微生物作为激活对象,通过对比好氧和厌氧条件下的激活规律和代谢特征,明确提高厌氧代谢速率的限制因素,为中高温油藏内源微生物激活体系设计和厌氧代谢调控提供理论依据。

1 区块概况

胜利油田沾3区块位于山东省东营市河口区境内,为复杂断块稠油油藏。含油面积1.5 km2,地质储量2.82×106t,油藏埋深1.24～1.36 km。油层温度为60 ℃,地面原油平均黏度(50 ℃)为1.885 Pa·s,地层水总矿化度为8～10 g/L。目前已进入高含水开发阶段,采出程度25%,综合含水达92%,水驱效果差,稳产难度大[23]。区块产出液的菌群分析结果表明,油藏内源微生物种类丰富,存在假单胞菌、芽孢杆菌和产甲烷菌等驱油功能菌,具备开展内源微生物激活研究的物质基础[19,24]。为了进一步提高沾3区块内源微生物驱油效果,以油井产出液中内源微生物菌群为激活对象,进行好氧和厌氧条件下激活规律和代谢特征研究。

2 材料与方法

2.1 激活样品

激活样品来自胜利油田沾3区块油井的产出液,样品采集后立即放入密封容器中送至实验室激活培养。

2.2 实验方法

2.2.1 激活剂体系

激活剂所用试剂包括:糖蜜、玉米浆干粉(工业级),K2HPO4、NaNO3(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)。分别设计4种不同激活剂体系,1号:糖蜜3 g/L、玉米浆干粉3 g/L。2号:糖蜜3 g/L、玉米浆干粉3 g/L、K2HPO42.7 g/L、NaNO36 g/L。3号:糖蜜3 g/L、玉米浆干粉3 g/L、NaNO36 g/L。4号:糖蜜3 g/L、玉米浆干粉3 g/L,K2HPO42.7 g/L。沾3区块油井产出液用滤纸进行过滤,过滤后的水样用于配制激活剂体系。

2.2.2 好氧激活

取2个250 mL三角瓶分别加入1号和2号激活剂体系80 mL,121 ℃灭菌20 min,分别接入20 mL沾3区块油井产出液,60 ℃、180 r/min振荡培养。

2.2.3 厌氧激活

在亨盖特厌氧操作平台配制1号、2号、3号、4号激活剂体系并分装,250 mL厌氧瓶中加入激活剂120 mL,121 ℃灭菌20 min,分别接入30 mL沾3区块油井产出液,60 ℃静置培养。

2.3 激活后菌密度检测

在无菌条件下,分别取好氧和厌氧培养3、5、7、14 d的样品,利用血球计数板在显微镜下进行菌密度指标的检测[19]。

2.4 乳化指数测定

在无菌条件下,分别取好氧和厌氧培养1、3、5、7、14 d的样品进行乳化指数测定,评价不同激活条件下微生物产乳化剂能力。在试管中加入5 mL激活样品和5 mL柴油,漩涡振荡器充分振荡2 min,静置24 h后,乳化层高度占有机相总高度的百分比即乳化指数[19]。

2.5 挥发性脂肪酸检测

将好氧和厌氧激活条件下培养不同时间的样品分别取样,离心后上清液进行挥发性脂肪酸检测。挥发性脂肪酸分析的进样量为50 μL,进样温度为300 ℃,火焰离子化检测器(FID)温度为300 ℃,升温程序为 100 ℃(3 min)—10 ℃/min—240 ℃(20 min),载气为恒流1 mL/min 的N2[24]。

2.6 气压和气体组分测定

气压测定:利用精确小量程气压表(上海荣华仪表厂)检测厌氧瓶内顶空压力,评价两种营养体系激活微生物代谢产气能力。气体组分测定:采用GC2010型气相色谱(日本岛津公司)测定气体组分及各组分含量。安装有气相色谱热导检测器(TCD)、Porapak Q型不锈钢填充柱的岛津气相色谱,进样口、柱箱和检测器的温度分别是50、50和70 ℃,载气为高纯H2(99.999%),流速为50 mL/min[25]。

2.7 DNA提取

取激活后样品高速离心(12 000 r/min、4 ℃高速离心15 min)收集菌体。利用AxyPrep基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,提取的DNA用于后期菌群结构分析。

2.8 驱油功能菌定量检测

功能菌定量检测采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)标准曲线检测方法,定量反应试剂为Bio-Rad公司的SYBR Green supermix试剂盒,反应体系包括上下游引物各1 pmol/L,预混液10 μL,待测样品或标准质粒1 μL,用灭菌的去离子水调整体系到20 μL。反应程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s。收集荧光信号,扩增40个循环,标准质粒与待测样品同时反应。荧光定量PCR反应及数据分析在Bio-Rad公司的IQ5型仪器上完成[26]。

2.9 高通量测序解析微生物群落结构

选择好氧和厌氧条件下激活后样品进行高通量测序,解析不同激活条件下菌群结构的变化规律。测试样品送至华大基因科技有限公司进行16S rDNA V4 区高通量测序,通用引物和反应程序参考文献[27]。

3 结果分析

3.1 好氧和厌氧激活后菌密度与驱油功能菌定量分析

对沾3区块油井产出液的内源微生物分别进行好氧激活和厌氧激活,激活后菌密度(c)变化见图1。由图1可得:培养5 d以上，好氧和厌氧条件下菌密度均超过108个/mL,表明油藏内源微生物能被有效激活,这是产生驱油效果的前提和基础。相同营养体系和相同培养时间下,好氧激活的菌密度高于厌氧激活的,说明微生物好氧条件下生长繁殖速率快。厌氧条件下在糖蜜、玉米浆等有机营养体系中添加磷酸盐和硝酸盐(2号体系),能有效促进微生物在厌氧条件下的生长代谢,14 d菌密度达到最大值4.4×108个/mL,达到好氧激活7 d时的菌密度水平。

图1 油井内源微生物厌氧和好氧激活菌密度Fig.1 Bacteria density by aerobic and anaerobic activation of endogenous microorganisms in oil reservoir

根据微生物提高原油采收率的机制,重点对产甲烷、产乳化剂等驱油功能菌进行定量检测。产甲烷菌将有机物转化为甲烷是一个多酶促反应,其中甲基辅酶 M 还原酶(MCR)是产甲烷过程中的关键酶和限速酶。MCR基因的α亚基(mcrA)基因序列在进化上具有高度保守性,因此,mcrA基因可以作为产甲烷菌定量检测的目标基因。由于乳化剂产生的功能基因不明确,无法选择一个功能基因对所有的产乳化剂菌进行定量检测,因此本文选择地芽孢杆菌属内一段特异性的保守序列对产乳化剂菌进行检测[28]。

好氧和厌氧激活后产甲烷菌和产乳化剂菌的菌密度随时间变化情况见图2。由图2可以看出:只有厌氧条件下激活才能检测到产甲烷菌,因为该菌是一种严格厌氧菌,和其他细菌形成一种特殊的互营关系,持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷。油井产出液中营养匮乏,1号有机营养激活体系中产甲烷菌数量明显最高,14 d菌密度超过106个/mL,这表明该体系有利于产甲烷菌的增殖;2号体系中磷酸盐、硝酸盐的加入,氧化还原电位提高抑制了产甲烷菌的生长活性,随着电子受体的消耗,14 d菌密度达到104个/mL。产乳化剂菌在好氧条件下的激活效率明显高于厌氧条件,表现在菌密度峰值高(接近107个/mL),到达峰值的时间早(7 d),这符合大部分产乳化剂菌为好氧菌的代谢特征。营养组分的调控也能实现油藏内源微生物中产乳化剂菌在厌氧条件下的有效激活,但与好氧激活相比,菌密度达到峰值的时间延迟到14 d,最大菌密度略有降低(接近106个/mL)。上述研究说明微生物采油技术在矿场试验过程中,不同激活方式下,激活剂在油藏停留时间要有所不同,厌氧激活时要让激活剂在油藏中停留更长的时间,保证厌氧乳化等采油功能菌达到菌密度峰值,由此指导现场试验进行注采强度调整[29-32]。

图2 油藏内源微生物好氧和厌氧激活后驱油功能菌密度变化Fig.2 Changes of density of functional bacteria by aerobic and anaerobic activation of endogenous microorganisms in oil reservoir

3.2 好氧和厌氧激活后乳化能力分析

油井产出液中内源微生物好氧、厌氧激活后的乳化指数结果如图3所示。由图3可以看出:与厌氧条件相比,微生物更易于在好氧条件下代谢产乳化剂,激活1 d就具有乳化能力,5 d乳化指数达到100%。总体上，相同营养体系下厌氧激活的乳化指数均低于好氧激活的,这与产乳化剂菌的菌密度变化规律一致,菌密度与乳化效果呈一定的正相关性[27]。厌氧激活3 d后表现出乳化性能,通过营养组分中磷酸盐和硝酸盐的调控,显著提高了内源微生物厌氧代谢产乳化剂的能力,2号体系培养14 d后乳化指数提高到100%(图4),促进了厌氧条件下对原油的乳化。上述实验结果与李忠洋等[24]发现的地衣芽孢杆菌厌氧生长代谢产乳化剂规律一致,添加适当比例电子受体对微生物厌氧代谢产乳化剂具有促进作用,但高浓度电子受体条件下会降低微生物合成乳化剂途径的代谢效率。

图3 内源微生物厌氧和好氧激活乳化指数Fig.3 Emulsification index of indigenous microbes by aerobic and anaerobic activation

图4 好氧和厌氧激活14 d原油乳化情况Fig.4 Emulsification of oil under aerobic and anaerobic condition

通过激活剂组分调控实现了油藏微生物在厌氧环境中生长、代谢产乳化剂,从而起到原位驱油的作用,有效弥补了必须注入空气才能保持好氧微生物在油藏原位生长代谢活性的不足,对内源微生物驱油效率的提高有重要的理论意义和应用价值。因此在微生物采油过程中进行电子受体调控,希望提高菌群乳化功能时可以通过注入空气或者硝酸盐等提高氧化还原电位,但配注空气存在一定的安全性,且地面需要建造注气装置,而注入硝酸盐等电子受体更安全、便捷。

3.3 好氧和厌氧激活后产酸产气能力分析

乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸是微生物厌氧代谢的重要中间产物,能溶解储油岩层孔隙中沉积的碳酸盐、硅酸盐等,提高油藏孔隙度和渗透率,改善原油流动环境;另外,产生的挥发性脂肪酸还可以作为其他菌群生长的底物,将挥发性脂肪酸转化为CH4、CO2等,因此在内源激活中是一个重要的监测指标[14,33]。油井内源微生物代谢产挥发性脂肪酸情况见图5。由图5可以看出:内源微生物厌氧激活后产生的挥发性脂肪酸的总量(1号，2.769 g/L)明显高于的好氧激活(1号，0.345 g/L),厌氧激活条件下磷酸盐、硝酸盐加入后提高了氧化还原电位,使代谢过程向产CO2气体方向进行[25],总酸含量从2.769 g/L降至1.046 g/L。

图5 好氧和厌氧激活对源微生物代谢产挥发性脂肪酸的影响Fig.5 Effects of aerobic and anaerobic activation on volatile fatty acids produced by indigenous microbes

微生物代谢产生大量的生物气,这些气体溶解于原油从而降低原油黏度,提高原油流动能力,同时提高储层压力,在微生物驱油过程中能够提高原油的采收率,这是微生物驱油的另一个重要机制。在激活14 d时测气压并收集气体进行气体组分分析,结果见表1。从表1可以看出:与产甲烷菌变化规律相同,1号激活剂体系厌氧激活后,产气量较大。1号体系激活14 d后，气压达到0.156 MPa,气体组分以CH4、CO2为主,含量分别为31.1%、28.5%;2号体系中加入磷酸盐和硝酸盐后,气压降低至0.060 MPa,气体组分以CO2为主(52.0%),CH4含量从1号体系的31.1%降低至5.6%。该结果同样说明低氧化还原电位有利于菌群产CH4,而磷酸盐和硝酸盐加入后提高氧化还原电位,使挥发性脂肪酸等中间代谢物朝产CO2方向转变。笔者进一步研究磷酸盐和硝酸盐对产甲烷菌的影响,结果见图6。由图6可以看出:相同培养时间下,添加磷酸盐的4号体系中产甲烷菌密度明显高于添加硝酸盐的3号体系。但随着微生物对激活体系中硝酸盐的不断消耗,氧化还原电位会降低,硝酸盐对产甲烷过程的抑制逐渐解除,产甲烷菌密度逐渐升高,最终与磷酸盐激活体系中产甲烷菌密度相当。通过添加电子受体调控厌氧激活油藏菌群实现乳化和产气时,添加硝酸盐电子受体有利于原油乳化[24],但不利于产CH4。因此,在微生物采油过程中，为了大量产CH4,应降低体系的氧化还原电位,避免加入大量硝酸盐。

图6 磷酸盐和硝酸盐对产甲烷菌密度影响Fig.6 Effects of phosphate and nitrate on the density of methanogens

表1 厌氧代谢产气气压和气体组分分析

Table 1 Gas composition of indigenous microbes by anaerobic activation

激活剂体系气压/MPa体积分数/%CH4CO2O2N2 1号0.15631.128.50.1340.27 2号0.0605.652.00.2742.13

3.4 好氧和厌氧激活后微生物群落结构差异性

油藏内源微生物群落结构在不同激活剂体系和激活方式下存在显著差异,结果如图7所示。由图7可以得到:好氧激活的优势菌以芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)为主,代谢产物多为生物表面活性剂类,菌群多样性明显高于厌氧激活[34]。厌氧激活优势菌则包括厌氧小杆菌(Anaerobaculum)、嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)、高温套管菌(Thermosipho)、栖热粪杆菌(Coprothermobacter)、热袍菌(Thermotoga)。其中,Thermoanaerobacter和Thermotoga是高温油藏主要存在的细菌种属。Thermotoga在高温环境中厌氧转化烃的过程中起非常重要的作用[35]；Thermoanaerobacter发酵有机营养组分产乙醇、乙酸、H2和CO2[13];Coprothermobacter厌氧生长,有蛋白水解作用,发酵蛋白产乙酸、H2和CO2;Anaerobaculum是一类嗜热厌氧生长的发酵菌,能够利用有机营养组分代谢产生乙酸。这些功能菌首先将大分子有机营养组分降解为小分子有机物,经过产甲烷菌作用进一步转化成CH4,由这些功能菌群协同作用,完成厌氧代谢过程。随着2号激活体系中磷酸盐和硝酸盐的添加,氧化还原电位升高,Anaerobaculum丰度逐渐降低,从42.2%降至5.2%,Thermoanaerobacter丰度逐渐升高,从9.7%升至45.1%。菌群结构的差异性造成上述不同激活方式下挥发性脂肪酸、产气、乳化等功能的显著差异,因此在微生物采油过程中要密切关注油井产出液中菌群结构的变化,因为其变化将会引起采油功能的变化,应根据菌群的变化及时进行激活调控策略的调整,以达到最佳的驱油效果[36-38]。

4 结论

1)好氧和厌氧条件下均能实现油藏内源微生物的有效激活。好氧条件下更易于激活微生物代谢产乳化剂,并且乳化指数高于厌氧激活,相应的产乳化剂菌密度高于厌氧激活。厌氧条件下通过激活剂组分中电子受体的调控,也能够实现油藏内源微生物厌氧代谢产乳化剂,促进了油藏环境下的原油原位乳化,好氧激活和厌氧激活所产乳化剂是否相同需要今后深入研究。

2)从厌氧激活后挥发性脂肪酸积累和产气情况来看,内源微生物营养体系中氧化还原电位提高不利于产酸、产CH4,总酸含量从2.769 g/L降至1.046 g/L,气压从0.156 MPa降至0.060 MPa,CH4含量从31.1%降至5.6%。

3)菌群结构组成、优势菌种类与营养组分、好氧厌氧激活方式存在密切联系。O2的存在对地层中不同种群微生物的生长代谢有明显影响,好氧激活以代谢产生物乳化剂类菌群为主,厌氧激活以发酵产酸、产气功能菌为主,两种代谢过程存在差异但又相互关联。