达格列净对糖尿病大鼠睾丸损伤的保护效应

梅志杰,杨慧娟,陈梦杰,郭园园,潘 艳,徐 宇,孙 妍,梁金宝,杨小淮*

(1蚌埠医学院第一附属医院泌尿外科,蚌埠 233000;2蚌埠医学院第一附属医院肾内科;3蚌埠医学院生命科学学院;4蚌埠医学院临床医学院;*通讯作者,E-mail:yxhyhr@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种慢性代谢性疾病,主要特点表现为血糖异常升高,从而引起严重的并发症,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是糖尿病的常见形式,主要占糖尿病病例的90%[1,2]。根据最新数据统计证实:目前全球大约有5亿人罹患糖尿病,到2045年,全球糖尿病患者人数将达到7亿左右,尽管对于糖尿病诊断和治疗愈发完善,但目前糖尿病仍是巨大的医疗负担[3]。近年来,糖尿病引起的男性生殖功能异常引起人们的广泛关注,流行病学研究表明90%的糖尿病患者会出现生育功能紊乱[4]。糖尿病患者男性不育率较高,可能是由于持续的高血糖刺激,炎症反应及氧化应激影响生殖器官、细胞及生殖激素等[5-7]。作为炎症反应的重要组成部分,已有研究证实NLRP3炎性小体通路参与了糖尿病的发生及发展过程[8,9]。

钠-葡萄糖转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT-2)抑制剂是近年来上市的新型降糖药物,广泛用于T2DM的治疗,达格列净是SGLT-2抑制剂的一种。研究证实,达格列净(dapagliflozin)通过降低血糖、血压、甘油三酯及胰岛素抵抗发挥对肾脏、心脏等保护效应[10-12]。Ye等[13]研究证实达格列净可以降低NLRP3炎性小体的表达,从而保护糖尿病所造成的心脏损害,随后Birnbaum等[14]亦证实了达格列净抑制NLRP3炎性小体的表达对肾脏具有保护作用。近年来越来越多的研究证实达格列净亦可以通过抑制氧化应激反应来降低糖尿病的风险[15,16]。但达格列净是否对糖尿病诱导的睾丸损害具有保护效应尚未有报道,故本实验通过建立2型糖尿病模型,观察糖尿病大鼠睾丸损害情况,并用达格列净干预,观察其对睾丸是否具有保护作用并探讨具体机制,为开发出药物新用途提供理论依据和实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠,清洁级,8周龄左右,体质量200-220 g,购买于蚌埠医学院实验动物中心,生产许可证号:SCXK(豫)2019-0002。大鼠饲养于温度、湿度适宜的动物房,并进行12 h明暗循环,自由进食、饮水。本研究严格按照蚌埠医学院伦理委员会要求进行(批准号:2020-227)。

1.2 实验材料

链脲佐菌素(STZ)购于北京索莱宝公司,达格列净购于阿斯利康中国制药公司,丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、苏木精伊红染料均购于上海碧云天生物技术公司,Trizol购于美国Invitrogen公司,逆转录试剂盒购于美国Thermo Scientific公司,RT-PCR试剂盒购于日本Takara公司。NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1和GAPDH引物均由上海生工生物工程公司所合成,序列见表1。

表1 用于RT-PCR分析的引物序列

1.3 实验方法

1.3.1 T2DM模型的建立及干预方式 大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组(NC组,n=6)和T2DM模型组(n=12)。正常组喂食基础饲料;T2DM模型组喂食高糖高脂饲料[17](67%基础饲料、10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、0.5%胆酸钠),喂养4周后,禁食12 h,T2DM模型组一次性腹腔注射45 mg/kg的STZ,正常组则腹腔注射等剂量的枸橼酸缓冲液进行对照。72 h后尾静脉采血测量空腹血糖(FBG),以空腹血糖≥16.7 mmol/L确定为T2DM模型建立成功。将建模成功的大鼠分为T2DM组和达格列净组(Dap组),用0.5%的羧甲基纤维素钠将达格列净片剂配制成1 mg/ml的溶液,灌胃剂量为每天10 mg/kg[18],正常组和T2DM组则灌以等量的羧甲基纤维素钠溶液。连续灌胃8周后,处死大鼠,收集血液、睾丸。

1.3.2 空腹血糖及血睾酮的检测 禁食12 h后,用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,将大鼠置于解剖台,打开腹腔后腹主动脉采血留取血标本,于全自动生化分析仪上检测空腹血糖及血睾酮(testosterone)含量。

1.3.3 睾丸组织病理学检测 按照上述方法处死大鼠后,取出睾丸组织,在预冷PBS中冲洗2遍后滤纸吸干并称重,计算睾丸质量系数,睾丸质量系数(TW/BW)=(睾丸质量/大鼠体质量)×100%。一侧睾丸保存于-80 ℃冰箱用于后续氧化应激及RT-PCR检测。另一侧睾丸则用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后,切片进行HE染色,至少由2位资深病理专家于显微镜下读片,观察睾丸组织生精小管及各层生精细胞改变情况。

1.3.4 睾丸MDA和SOD指标的检测 称取30 mg睾丸组织,加入300 μl PBS,制备10%的睾丸匀浆液。4 ℃,12 000g将匀浆液离心15 min,收集上清,BCA测定匀浆液浓度后,按照试剂盒所述比色法检测MDA及氮蓝四唑(NBT)显色法检测SOD含量。

1.3.5 RT-PCR检测睾丸组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的水平 通过Trizol试剂从睾丸组织中提取总RNA。用逆转录试剂盒将2 μg总RNA逆转录成cDNA。使用SYBR Green Super Mix试剂盒,以2 μl cDNA为模板,总体积为20 μl的体系,条件为:预变性,95 ℃,180 s;以变性:95 ℃,30 s;退火:6 0℃,30 s;延伸72 ℃,15 s,反应45个循环。用PT-PCR仪分析Ct值,用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠一般状况

除了NC组,T2DM组与Dap组大鼠均出现饮水、饮食增多,小便增多,垫料潮湿,体质量减轻等表现。

2.2 各组大鼠空腹血糖水平

与NC组比较,T2DM组大鼠空腹血糖明显增多[(7.66±1.54)mmol/Lvs(28.93±2.13)mmol/L,P<0.001];经过达格列净治疗8周后,Dap组大鼠血糖值较T2DM组明显降低[(28.93±2.13)mmol/Lvs(20.12±3.47)mmol/L,P<0.001,见图1]。

与NC组相比,***P<0.001,与T2DM组相比,###P<0.001图1 各组大鼠空腹血糖变化情况Figure 1 Changes of fasting blood glucose(FBG) in rats

2.3 各组大鼠血睾酮水平

与NC组比较,T2DM组大鼠血清睾酮含量明显降低[(1.62±0.25)μg/Lvs(0.47±0.09)μg/L,P<0.001];经过达格列净治疗后,Dap组大鼠睾酮值较T2DM组明显增加[(0.47±0.09)μg/Lvs(0.91±0.12)μg/L,P<0.001,见图2]。

与NC组相比,***P<0.001,与T2DM组相比,###P<0.001图2 各组大鼠血清睾酮变化情况Figure 2 Changes of serum testosterone in rats

2.4 各组大鼠睾丸质量系数变化

相比于NC组的大鼠睾丸质量系数,造模后T2DM组大鼠睾丸质量系数明显增加[(0.80±0.10)%vs(1.33±0.13)%,P<0.001];达格列净干预后,睾丸质量系数较T2DM组明显下降[(1.33±0.13)%vs(1.00±0.07)%,P<0.001,见图3]。

与NC组相比,***P<0.001,与T2DM组相比,###P<0.001图3 各组大鼠睾丸质量系数变化Figure 3 Changes of TW/BW in rats

2.5 各组大鼠睾丸病理学改变

HE染色观察三组大鼠睾丸组织形态,结果发现:NC组大鼠生精小管中精原细胞核大而圆,贴于基膜内,排列整齐,各级精母细胞层数清晰可见,近管腔侧可见大量精子细胞,管腔内充满精子;T2DM组生精小管形态明显受损,各级生精细胞减少,层数减少,排列紊乱,腔内精子明显减少;Dap组精原细胞较T2DM组明显增多,各级精母细胞层数及数量较T2DM组增多,腔内可见少量精子(见图4)。这些结果均表明糖尿病可导致睾丸发生病理损害,达格列净可改善糖尿病诱导的睾丸功能障碍。

黑色箭头所指为生精细胞;黑色三角形所指为精子图4 各组大鼠睾丸病理结构变化情况 (HE染色,×200)Figure 4 Pathological changes of the testis in rats (HE staining,×200)

2.6 各组大鼠MDA和SOD水平

结果表明,T2DM组MDA水平较NC组明显增多(P<0.001),而T2DM组SOD水平较NC组明显下降(P<0.01)。达格列净治疗后,Dap组MDA水平较T2DM组显著下降(P<0.001),SOD水平则明显升高(P<0.05,见图5)。

与NC组相比,**P<0.01,***P<0.001；与T2DM组相比,#P<0.05,###P<0.001图5 各组大鼠睾丸MDA和SOD水平Figure 5 The levels of MDA, SOD in the testes of rats

2.7 各组大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表达情况

与NC组比较,T2DM组大鼠睾丸组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的相对表达量明显增加(P<0.001),达格列净治疗后,Dap组大鼠上述基因相对表达量较T2DM组显著下降(P<0.01,见图6)。

与NC组相比,***P<0.001,与T2DM组相比,##P<0.01,###P<0.001图6 各组大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α、TGF-β1 mRNA的表达水平Figure 6 The levels of NLRP3, ASC, Caspase-1, IL-1β, TNF-α, TGF-β1 mRNA in rats

3 讨论

随着生活方式及生活环境的改变,T2DM已经成为一种全球流行病,其伴随而来的并发症对全球健康构成主要威胁。除了人们熟知的心脏、肾脏损害,近年来T2DM所并发的生殖系统损伤引起了人们的广泛关注[19,20]。持续的高血糖刺激,可以改变精液质量,诱导生精细胞凋亡,破坏血-睾屏障,抑制睾丸激素分泌等,从而损害男性患者生育能力[21,22]。本实验通过高糖高脂饮食联合小剂量STZ,破坏胰岛β细胞,建立T2DM模型。本研究发现,造模后大鼠出现多饮、多食和多尿等临床表现,空腹血糖增加,体质量减轻,睾丸质量系数增加,睾丸发生萎缩。组织学结果表明睾丸生精小管发生明显变化,生精细胞数量明显减少,血清睾酮值下降,这一系列结果均提示糖尿病刺激导致睾丸功能障碍。

近年来,作为炎性反应重要组成部分,NLRP3/ASC/Caspase-1炎性小体通路与多种炎症性疾病如痛风、动脉粥样硬化、糖尿病等关系备受关注,NLRP3炎性小体的激活可以导致活性Caspase-1及IL-1β产生,分泌的IL-1β促进TNF-α、IL-6等炎性因子的分泌,从而增强了机体炎症反应[23-25]。NLRP3炎性小体通路介导的炎症反应与氧化应激关系密切,活性氧(ROS)可以激活NLRP3促进组织炎症并激活免疫反应[26]。越来越多的研究证实氧化应激在T2DM的并发症中发挥重要作用,MDA是脂质过氧化的重要指标,代表性抗氧化物质SOD可以保护组织免受自由基的损害。动物实验证实,抑制MDA、增加SOD的产生,可以明显改善T2DM并发的睾丸损害[27],Liu等[28]亦证实降低NLRP3介导的炎症反应,对T2DM并发的肾脏具有保护作用。T2DM模型建立成功后,我们观察到大鼠睾丸组织中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平明显增加,提示糖尿病可能激活NLRP3/ASC/Caspase-1炎症小体通路,引起促炎基因IL-1β、TNF-α的表达量增加,介导睾丸损害,MDA含量增加,SOD含量降低,提示糖尿病可能通过NLRP3炎性体通路介导睾丸组织发生过氧化反应。研究证实,TGF-β1参与调节类固醇的合成、精子的生成与发育等,持续的血糖刺激可诱导TGF-β1大量表达,从而诱导生精细胞凋亡,导致睾丸功能障碍[29,30]。我们发现T2DM组大鼠TGF-β1 mRNA表达水平较NC组显著增加,并观察到睾酮水平下降及生精细胞明显受损。

达格列净抑制肾小管SGLT-2减少葡萄糖的吸收,促进其排泄,从而独立于胰岛素而降低葡萄糖水平,降糖效果优于其他传统药物。学者们发现达格列净可降低机体炎症反应、氧化应激等过程,从而改善糖尿病所造成的并发症损害。动物实验证实了这一点,达格列净通过抑制NLRP3炎性小体信号及氧化应激水平来降低糖尿病损害[31]。本研究发现,达格列净治疗后,可明显降低T2DM大鼠的血糖水平及睾丸质量系数,血睾酮值增加,睾丸生精细胞数量增多,损伤减轻。本研究亦发现,与模型组比较,达格列净干预后NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、TNF-α和TGF-β1的表达量明显下调,过氧化指标MDA明显下降,抗氧化指标SOD显著增多,该结果提示达格列净可能通过抑制NLRP3炎性小体增加机体抗炎症、抗氧化反应,减轻糖尿病所并发的睾丸损伤。

综上所述，在T2DM所并发的睾丸损伤中,达格列净可以降低NLRP3炎性小体,降低睾丸组织发生炎症反应及氧化应激从而改善糖尿病大鼠睾丸损害,为临床上治疗男性糖尿病生殖系统疾病提供新思路。