绿原酸眼用温敏型凝胶的制备及兔眼房水内药动学研究

李新南 景年水

济南市第二人民医院药剂科 250001

绿原酸是中药金银花中的主要成分，是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，又称为咖啡鞣酸，属于苯丙素类化合物［1］。其具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、降血脂、降血糖和免疫调节等多方面的药理作用，在食品、医药和化工等领域具有广泛的应用［2-5］。金银花因其清热解毒，可治疗风火目赤，常用于治疗暴发火眼、目赤肿痛、疮痈肿毒等，临床上广泛用于治疗单疱病毒角膜炎、沙眼、结膜炎等［6］。

传统的滴眼液由于泪液分泌、眨眼反射、鼻泪管排出等造成药物作用时间短，一般滴眼液具有超过70%的药液损失，生物利用度低［7］。另外，大量的药物可以经鼻泪管进入鼻腔或者消化道从而被全身吸收，势必大大增加诱发各种不良反应的风险。开发以泊洛沙姆等高分子材料为基质的新型眼用温敏凝胶，以液态形式滴入眼部，在结膜囊内形成凝胶呈半固体状态，不仅可以解决普通滴眼液眼内滞留时间短、生物利用度低的问题，还可以克服普通眼用凝胶缺乏良好的铺展性及计量不易控制等诸多问题，具有良好的应用和发展前景［8］。本实验于2020年1月至10月以泊洛沙姆为温敏材料制备绿原酸温敏凝胶，给药后采用高效液相色谱法（HPLC）以及微透析技术测定不同时间绿原酸在眼房水中含量，比较绿原酸滴眼液与绿原酸温敏凝胶在家兔眼内的药动学特征。

1 材料与仪器

1.1 仪器 微渗析系统（微量泵控制器和MD-1001型微量注射泵，美国BAS 公司）；LM-10微渗析探针（美国BAS公司）；裂隙灯显微镜（日本尼德科公司）；Agilent1260 高效液相色谱仪（DAD 检测器）；SYC-15 超级恒温水浴（南京桑力电子设备厂）；BS110S 电子分析天平（德国塞多利斯公司）；KQ-5200E型医用超声波清洗器（功江苏昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 绿原酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号B20782）；绿原酸，山东中医药大学药学院提供，纯度97%；泊洛沙姆188（Pluronic F68，BASF 德国）；泊洛沙姆407（Pluronic F127，BASF 德国）；甲醇（色谱纯，天津四友）；乙腈（色谱纯，天津四友）；纯净水（哇哈哈，市售）；其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 新西兰大耳白家兔［济宁鲁抗公司，动物饲养合格证SCXK（鲁）20130001］，雌雄各2 只，体质量2.2～2.5 kg，裂隙灯显微镜下检查双眼无疾病，单笼饲养。

2 方法与结果

2.1 绿原酸眼用温敏凝胶的制备 精密称取绿原酸适量，溶于注射用水中，配成4%（mg/ml）溶液，加入20%的泊洛沙姆407 和1%的泊洛沙姆188，室温搅拌后置于4 ℃冷藏，完全溶解后，加入5% 的苯扎溴铵使其浓度为1/10 000，制得绿原酸眼用温敏凝胶，混匀，滤过灭菌，分装，即得。测定其pH 为7.01，相变温度为26.9 ℃，人工泪液稀释后胶凝温度为33.8 ℃，所得凝胶为淡黄色、均匀，在储存期为液态，滴入眼内形成凝胶呈半固体状态。

2.2 眼部药代动力学

2.2.1 房水药物浓度HPLC分析方法的建立

2.2.1.1 色谱条件的选择 Diamond C18色谱柱，柱温25 ℃，检测波长318 nm，流速1.0 ml/min，流动相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱时间程序（%）

2.2.1.2 方法专属性考察 在上述色谱条件下，制备空白渗析液样品，进样，得渗析液样品色谱图，结果见图1。由结果可以看出，在上述色谱条件下，空白渗析液对绿原酸测定无干扰。

图1 空白渗析液与给药后透析液样品（A为绿原酸透析液，B为空白透析液）

2.2.1.3 标准曲线的制备 精密称取绿原酸适量，精密加入流动相稀释，制成每毫升溶液含绿原酸38.16µg，摇匀，即得绿原酸对照品溶液。分别进样3、6、9、12、15µl，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，做标准曲线，结果见图2。

图2 绿原酸标准曲线

2.2.1.4 方法学考察 精密度、重复性及稳定性方法学考察符合规定。

2.2.2 植入探针与给药 术前30 min 以及手术后4 h，于家兔耳缘静脉注射100 U/kg 肝素钠。家兔眼结膜下注射2%利多卡因表面麻醉，开睑器撑开眼睑，用5#针头于角膜结膜缘前1 mm 处斜刺入眼前房室内，LM-10微渗析探针沿针孔导入眼前房内，弃去针头，调整渗透窗使其全部置于房水中，探针的两端分别固定于鼻颞侧和外眼角。窗口处给予一定抗生素滴眼液预防感染，恢复至伤口完全愈合后，微注射泵以1.0 µl/min 流速向探针内灌装0.9%氯化钠注射液，平衡一定时间后开始给药。食指与拇指分开家兔上下眼睑，分别将50µl 绿原酸滴眼液、绿原酸温敏凝胶滴在靠外侧眼角白眼珠下方的结膜囊内，将上眼睑稍稍提起，让药液尽可能保留在结膜囊内，然后轻轻闭合眼睑片刻，以增加药水与眼球接触时间，防止药物溢出，开始收集渗析液。

2.2.3 浓差法探针体外回收率 分别配制3 个1.0、2.0、3.0 mg/ml 不同浓度的绿原酸样品溶液，调整微渗析渗透窗的位置，保证其全部置于3 个不同浓度的样品生理盐水溶液中，分别调整微注射泵的流速为1、2、3µl/min，以氯化钠注射液为灌注液，每次平衡0.5 h，收集渗析液，HPLC法测定渗析液中绿原酸的含量。计算回收率，结果见表2。回收率（R）=Cd/Cin×100%，Cd 为渗析液药物浓度，Cin 为已知药物浓度。

表2 不同绿原酸浓度在不同微注射泵流速下的体外回收率（n=3，%）

由实验结果可知，绿原酸体外回收率均随着灌注液的流速的增大而呈明显的降低趋势，分析原因可能是在低流速下，探针渗析膜内外药物有充足的时间进行扩散，从而使更多的组织药物进入渗析液内，从而使相对回收率较高，并且实验中发现，低流速的灌注液组得到的渗析液中药物的浓度较高。灌注液高流速组由于缺少足够的时间进行平衡交换而造成回收率下降。但是，如果灌注速度太小，也会导致采集样品的体积较小，造成采集时间延长。因此，综合考虑，选择2.0µl/min作为灌注液流速。

2.2.4 反向渗析法测定在体探针回收率 家兔眼表面丁卡因麻醉后，植入探针至前房内，经过一定恢复期后，观察伤口完全愈合。分别配制0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml浓度的样品溶液。灌注液流速设定为2.0µl/min，以不同浓度样品生理盐水溶液进行灌注。每次更换灌注液后冲洗30 min，每一样品采集15 min，平行测定3次，结果见表3、图3。相对回收率（R）=Cd-Cp/Cm-Cp，其中Cd为渗析液中药物浓度，Cm为组织液中药物浓度，Cp为灌注液中的药物浓度，以Cd-Cp 对Cp 作图。由实验结果可知，以（Cd-Cp）对Cp 分别作图，得到线性方程Cd-Cp=-0.436 2 Cp+0.006 6，计算的回收率为（43.62±2.55）%。由实验结果可知，绿原酸在体回收率均低于体外回收率，可能与渗透膜表面的少量纤维化以及房水中大分子蛋白质等物质吸附、沉聚于膜表面从而阻碍药物扩散造成。

表3 反向渗析法测定绿原酸浓度

图3 反向渗析法测定绿原酸在体探针回收率

2.2.5 绿原酸制剂眼内药动学测定 设定流速2.0µl/min的生理氯化钠为灌注液，冲洗30 min 后，分别将50µl 绿原酸滴眼液、眼用绿原酸温敏凝胶滴在靠外侧眼角白眼珠下方的结膜囊内，将上眼睑稍稍提起，让药液尽可能保留在结膜囊内，然后轻轻闭合眼睑片刻，以增加药水与眼球接触时间，防止药物溢出，开始收集渗析液，在最开始的1 h 内，每隔15 min 取样1 次，然后30 min 取样1 次，共测定6 h。HPLC法测定渗析液中绿原酸的含量，结果见表4、图4。

表4 不用药物家兔局部给药后的房水药动学参数（n=4）

图4 家兔眼部房水中绿原酸浓度-时间曲线（n=4）

由实验结果可知，当绿原酸滴眼液作用于家兔眼部表明时，绿原酸立即透过角膜，作用较为迅速，但是由于药液的迅速流失，作用时间短，生物利用度低，并且眼睛具有流泪和眨眼反射等非常有效的保护机制，一般滴眼液具有超过70%的药液损失。滴眼液中绿原酸的药物浓度在0.5 h达峰，峰浓度为（2.390±0.427）µg/ml，然后逐渐降低，药时曲线下面积分别为（2.257±0.516）µg/（h·ml），当眼用绿原酸温敏凝胶作用于家兔眼部表面时，绿原酸的药物-时间AUC显著增大，绿原酸的Cmax 为（4.370±0.942）µg/ml，生物利用度为绿原酸滴眼液中的3.175倍，显著提高了绿原酸制剂中有效成分的生物利用度，并且Tmax 均有所延长。间接说明凝胶基质中对药物的释放具有阻滞作用，从而使药物可以持续释放并透过角膜进入房水，延缓了房水中药物浓度的降低。

3 讨 论

目前常用的眼内组织液的取样方法为穿刺取样法，通常为给药后在不同时间点处死动物，对房水或玻璃体进行一次取样，动物个体差异性较大，并且单次取样所得的样品集合是非连续性的。微透析技术能够在同一组织内连续不间断的取样，并且可以进行药物的动态监不但可以减少动物数量，还能减少误差，对组织损伤较小，可以排除麻醉剂和蛋白结合对药物测定的干扰，为眼部药物动力学的研究提供了新的手段［9-10］。本部分首先建立了HPLC 测定绿原酸含量的方法，利用浓差法测定探针体外回收率，反向渗析法测定在体探针回收率，建立了眼局部给药后在体测定药动学参数模型，降低了实验成本，实现了在体连续取样。实验中发现，在体回收率明显低于体外回收率，分析原因可能是由于探针植入后，造成局部的轻微损伤，从而在渗析窗表面形成纤维，从而使回收率降低。并且微透析技术也有不足之处，如样品采集量较小，有时候对分析结果有较大影响，植入眼部过程中稍有不慎便会造成眼部较为明显损伤，从而导致渗出明显等问题。

通过本实验结果发现，眼部分别滴入绿原酸滴眼液和眼用绿原酸温敏凝胶滴眼液后，两者的药动学参数有较大差异。绿原酸凝胶组的绿原酸的AUC 为绿原酸滴眼液的3.0 倍，且Cmax 和Tmax 均有明显增大，分析可能是温敏凝胶采用泊洛沙姆作为凝胶基质，提高了制剂的凝胶粘度和强度，增大了滴眼剂的黏滞度，可使药物在眼内停留时间延长，增加药物与角膜的接触时间，有效减少药物角膜前流失。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。