不同温度对香蕉果实丙二醛，呼吸速率和能量代谢影响

李朋超，孟陆丽，程谦伟*，胡波，杨菊，张萌

广西科技大学生物与化学工程学院（柳州 545006）

香蕉果实不仅营养成分丰富，而且所含的酚类化合物在降低患心血管疾病和癌症风险上有明显的作用，因此在国际市场上有很高的需求[1-5]。香蕉作为一种呼吸跃变型的热带水果，在常温下贮藏6~8 d后果肉快速软化，果皮变黄，使其具有较短的保质期[6-7]。低温存储已成为延缓果蔬成熟和延长果蔬贮藏期的最有效技术之一[8]。然而，香蕉果实和其他热带果实一样，对低温很敏感易发生冷害[9]。香蕉果实的冷害症状包括果皮快速褐变、发黑、点蚀和成熟异常，这大大降低了商品质量和消费者的接受度[10]。

能量是生命活动的基础，生物的所有生理活动都需要能量。越来越多的研究表明，水果的某些生理失调，包括褐变和冷害，可能与细胞能量水平的降低有关[11-12]。长期冷藏可能导致采后果实的ATP和能荷（EC）降低，从而导致能量代谢紊乱[13]。近年来有研究者对枇杷果、竹笋、黄瓜、桃、梨、芒果冷害与能量状态的关系进行了研究[14-20]。

目前，尚未有研究报道香蕉果实在不同温度储存中冷害发生程度与能量水平之间的变化。因此，试验分别对在25，13和5 ℃储存条件下香蕉果实的冷害指数、相对电导率、丙二醛、呼吸速率、表皮细胞结构和能量水平进行了研究，揭示香蕉果实冷害发生的机理，旨在为香蕉果实采后冷藏保鲜技术的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 水果材料和试验设计

香蕉购买产于广西南宁的高乐品种，采收期在5~6月。为减小误差，选择样品在成熟度（未成熟）、颜色（浅绿色）、形状和大小方面相似，并且没有瑕疵和外部缺陷的香蕉果实随机分为3组（每组30支），分别储存在25，13和5 ℃和相对湿度为85%的条件下，用于相关生理指标的测定。另外单独取45支香蕉，随机分为3组，每组15支（即每个温度15支香蕉），用于呼吸速率的测定。在贮藏期间每隔3 d采集一次样本。此外，由于冷害过程会产生褐变，为更准确对香蕉冷害分级，使用1.2图像处理装置。

1.2 仪器与设备

恒温恒湿培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司）；图像处理系统（自制）；FA-2104N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；H3-18KR高速台式冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；日立S-3400N扫描电镜（日立日本技术公司）；DDS-11A相对电导率仪（上海虹益仪器仪表有限公司）；TU-1950型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.3 香蕉图像采集系统

将香蕉样品放在装置托盘，数码相机安装在托盘上方约30 cm处，使用分辨率为600×400像素的数码相机（MER-503-36U3C，大恒水星，中国，北京）进行成像，图像以BMP格式保存。使用Matlab R2014a（Mathworks，美国）进行图像处理。采集装置如图1所示。

图1 系统整体结构图

1.4 香蕉的图像处理

香蕉表皮上的黑斑多呈黑色或深褐色，色彩偏暗片深；而正常香蕉通常呈黄色或绿色，颜色不深，并且香蕉拍摄箱体为铝合金板，在箱内光源照射下，背景偏白且亮度较高。因此，可以采用亮度特征将香蕉黑斑从图像中分割出来。香蕉图像中每一个像素点用R、G、B三个值表示其颜色，通过式（1），将每个像素点的颜色转化为一定的灰度值Y，从而将彩色图像转化为灰度图像。

此外，通过巴特沃思滤波器对图像进行预处理，消除例如图像直方图均衡化和图像传输引起的噪声的预处理操作。然后，通过执行Otsu自适应阈值方法提取阈值，对香蕉图像进行图像分割[21]。分割后的二值化图像，黑色的像素点的区域对应于香蕉的褐变区域，白色区域表示背景。

参考已有的图像特征提取方法，采用分割后二值区域像素点的个数表示香蕉图像的褐变面积。

1.5 冷害指数的测定

参考Yang等[22]的方法，并稍作修改。冷害程度分为5个等级，由褐变指数等级代替。褐变指数等级：0=无褐变；1=褐变面积＜25%；2=褐变面积25%~50%；3=褐变面积50%~75%；4=褐变面积大雨75%。冷害指数按式（2）计算。此处采用的褐变面积为图像采集到的由冷害引起的褐变面积。

1.6 呼吸速率的测定和扫描电镜

呼吸速率根据Chen等[23]的方法并稍作修改。呼吸速率的单位为mg CO2·kg-1·h-1。

参考Guo等[24]的方法，并稍作修改。用水冲洗除去果表的灰尘等异物。用双刃刀片切取长、宽约为3 mm×2 mm的果皮数块，投入0.1 mol/L PBS配制的2.5%pH 6.8的戊二醛溶液中，在4 ℃条件下固定24 h，固定好后的样品用0.01 mol/L的磷酸缓冲液漂洗3次。采用梯度叔丁醇分5级脱水，用体积分数为100%的叔丁醇浸没30 min，置于真空冷冻干燥机48 h，之后用电导胶把果皮粘贴在样品台上，粘贴时样品观察面朝上。用镀膜仪镀金膜，置于扫描电子显微镜（SEM）于5 kV加速电压下观察拍片。

1.7 相对电导率和丙二醛（MDA）含量的测定

参考Yang等[25]的方法，并稍作修改。用直径10 mm的打孔器取下10个果皮，蒸馏水清洗3次，用滤纸吸干，将果皮置于试管，加入20 mL去离子水，浸泡30 min测定溶液的初始电导率C0；再将大试管放到沸水浴中30 min，快速冷却，测定溶液的电导率C1。相对电导率以煮沸前后的相对电导率比值表示。

参考Zhang等[26]的方法，并稍作修改。称取1.0 g果皮样品，加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液，研磨匀浆，按10 000 r/min离心15 min，收集上清液。取2.0 mL上清液（对照空白管中加入2.0 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混匀后在沸水浴中20 min，取出冷却后离心。取上清液分别测定A450，A532和A600的吸光度。结果以μmol/g表示。

1.8 ATP，ADP和AMP含量和能荷（EC）的测定

参考Lin等[27]的方法，并稍作修改。取2.0 g果皮加入预冷的5 mL 0.6 mol/L高氯酸研磨后提取20 min，于4 ℃下，以12 000 r/min离心15 min。取3 mL上清液，用1 mol/L KOH将pH调至6.5~6.8，定容稀释到4 mL后用0.45 μm微孔滤膜过滤。ATP、ADP、AMP含量采用安捷伦1260高效液相色谱测定，分析柱采用C18反相柱（250 mm×4.6 mm，phenomenex，Luna，LC），二极管阵列检测器，测定波长为254 nm，进样体积20 μL，流速0.8 mL/min。流动相A为磷酸盐缓冲液，包含0.03 mol/L K2HPO4和0.02 mol/L KH2PO4，用0.1 mol/L KOH调节至pH 7.0，流动相B为甲醇。采用梯度洗脱，条件为0 min，100% A；7 min 80∶20（A∶B）；9 min，75∶25（A∶B）；10 min 100% A。最后延迟5 min恢复基线平衡。ATP、ADP、AMP含量通过外标法与标准样品进行比对。AXP=ATP+ADP+AMP。按式（3）EC计算。

1.9 数据分析

使用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析，Duncan多重范围检验确定均值之间的差异（p＜0.05）。试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 不同储存温度下香蕉果实冷害指数的变化

冷害是指0 ℃以上的不适低温对冷敏性果蔬在低温胁迫下造成的一种不良反应。从表1可以看出，在整个储藏阶段，5 ℃储存条件下香蕉果实从第3天开始出现冷害症状，表皮出现轻微的水渍状斑点，此时冷害指数为11.1%；随着储存时间的增加冷害程度加重，贮藏12 d时香蕉果实冷害症状表现严重，并且伴随出现水渍，斑点等症状，此时冷害指数为96.3%；13 ℃储存条件下香蕉果实在第9天出现轻微冷害症状，伴随根部果皮颜色发黑，此时冷害指数为6.3%；而25 ℃储存条件下的香蕉果实未发生冷害，但贮藏12 d时果实已经出现轻微腐烂。

表1 不同贮存温度下香蕉果实的冷害指数

2.2 不同储存温度下香蕉果实呼吸速率和表皮结构的变化

如图2所示，不同储存温度下的香蕉果实在储存初期呼吸速率降低，可能是适应新环境的应激反应；储存中期呼吸速率升高，可能是香蕉果实出现呼吸跃变，Lin等[28]对桂圆果实和Chen等[29]对龙眼果实的研究中也出现呼吸跃变。此外，由图2可知，低温贮藏没有推迟呼吸跃变的出现。5 ℃储存条件下香蕉果实的呼吸速率显著低于13 ℃和25 ℃储存条件下的呼吸速率，这一结论与苏新国等[30]对香蕉果实的研究结果相似，这表明低温会抑制香蕉的呼吸作用。

图2 不同的储存温度下香蕉果实的呼吸速率

扫描电镜观察表明（图3），在贮藏初期（第0天），香蕉果皮没有冷害，表皮细胞结构完整，细胞饱满，排列整齐有序，表面光滑无皱纹和裂纹，结构清晰，气孔开放程度较小（A1，A2，A3）；在贮藏中期（第6天），5 ℃储存条件下果实发生中度冷害，表皮细胞收缩，有序性下降（B1），25 ℃和13 ℃储存条件下表皮出现轻微的皱纹和裂纹，气孔开放程度变大（B2，B3）；在储存后期（第12天），5 ℃储存条件下香蕉果实冷害变得非常严重，表皮细胞结构被严重破坏，细胞皱缩（C1），25 ℃和13 ℃储存条件下香蕉果实表皮分裂成唇状突起形成皮孔，并且裂纹的长度和宽度增加，气孔收缩（C2，C3）。此外，在储藏初期气孔开放程度较小，储藏中期气孔开放程度变大，储藏后期气孔收缩的现象与呼吸速率变化趋势一致。

图3 香蕉在储存过程的扫描电子显微镜图像

2.3 不同储存温度下香蕉果皮的相对电导率和丙二醛含量的变化

冷害是造成细胞膜损伤的主要原因之一，相对电导率可反映果皮细胞膜的破坏程度。果蔬发生冷害时，细胞膜的通透性会增加甚至完全丧失，膜结构的完整性遭到破坏，相对电导率变大，膜脂过氧化程度加剧，而相对电导率越大，则细胞膜的完整性破坏越严重[31]。如图4所示，25 ℃贮藏条件下香蕉果皮电导率从第6天开始显著升高，此时香蕉的外观表现出黄化、伴随褐变斑点出现，这可能是贮藏过程中果皮的衰老导致相对电导率升高[32]；13 ℃贮藏条件下香蕉果皮的相对电导率处于较低水平；5 ℃贮藏条件下香蕉果皮的相对电导率变化趋势显著，在第12天增加74%，这可能是冷害引起了细胞膜损伤，致使电解质外渗[33]。

图4 不同的储存温度下香蕉果皮的相对电导率

ATP缺乏会诱导脂质过氧化，MDA作为膜脂过氧化的产物，其含量常用来表示果蔬衰老或冷害过程中细胞膜的膜脂过氧化程度和逆境伤害程度[34-35]。从图5可以看出，5 ℃储存条件下香蕉果皮的MDA含量显著高于其他两个储存条件下（p＜0.05），这可能是冷藏导致香蕉果皮的ATP和EC降低，从而导致能量代谢紊乱的结果[36]；13 ℃储存条件下的MDA含量缓慢上升，这可能是充足的ATP和EC供应保护膜完整性的结果[34]；而25 ℃储存条件下香蕉果皮MDA含量在储藏后期上升，可能是由于贮藏温度较高，促使了膜脂过氧化反应速率加快。

图5 不同的储存温度下香蕉果皮的丙二醛

2.4 不同储存温度下香蕉果皮ATP、ADP、AMP和能荷的变化

不同的储存温度下香蕉果皮ATP（D1），ADP（D2），AMP（D3），AXP（D4）含量和能量电荷（D5）如图6所示。能量是生命活动的基础，能量状态与生物学特性密切相关[37]。一般而言，无论储存温度的高低，果蔬的ATP和ADP含量均出现随储存时间的增加而逐渐降低的趋势[6]。如图6所示，在储存前期，香蕉果皮的ATP，ADP和EC含量较高（D1，D2，D5），而磷酸腺苷（AMP）的含量相对较低（D3）；随着储存时间的增加，ATP，ADP和EC的含量降低，AMP的含量增加。5 ℃储存条件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的下降幅度明显高于其他组（p＜0.05），在第12天，5 ℃储存的果皮显示出最低的ATP和ADP含量，这一趋势与Chen等[38]对桃果实的研究得到相似的结果；13 ℃储存条件下香蕉果皮的ATP和ADP含量的显著高于其他组（p＜0.05），在第12天储存结束时，13 ℃储存条件下香蕉果皮显示出最高的ATP和ADP含量。

图6

此外，随着温度的降低和保存时间的延长，5 ℃储存条件下香蕉果皮总腺苷核苷酸显著减少（p＜0.05）。因此，低温不仅减少了香蕉果皮中的EC数量，而且由于总腺嘌呤核苷酸的减少导致ATP的数量的减少，可能进一步加剧香蕉果皮冷害症状[6]。

3 结论

5 ℃下的香蕉果实 ATP、ADP含量和EC值最低，呼吸速率最低，细胞能量亏缺最严重，相对电导率和丙二醛含量最高，其存在典型的冻害症状，如褐变，水渍斑点和凹陷。13 ℃贮藏香蕉果实保持最高的能量水平，呼吸速率较高，相对电导率和丙二醛含量最较低，在第9天出现冷害症状。表明香蕉果实冷害发生与能量亏缺有密切关系，较高的能量水平有助于减轻冷害。