不同产地“云柠1号”柠檬油成分比较与分析

李源栋，李娟，段焰青，刘志华，尹开云，申钦鹏*

1. 云南中烟工业有限责任公司技术中心（昆明 650202）；2. 昆明香冠科技有限公司（昆明 650202）

柠檬（Citrus LimonBurm. f.）系芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus L.）常绿果树，主产于印度、墨西哥、阿根廷、巴西及中国云南，广东，广西，四川、海南等地[1]。柠檬枝、叶、花、皮、果均含有精油，其中果皮精油含量占其鲜重的0.5%~2.0%，主要含有单萜与倍半萜烯类化合物及其含氧衍生物如醇类、醛类、酯类等物质[2-3]。由于柠檬油富含有柠檬烯、柠檬醛等多种特殊活性成分，广泛应用于药品和化妆品等领域，具有护肤保健[4]、预防阿兹海默病[5]、调节神经元[6]、抗菌防腐[7-8]、抗肿瘤[9-10]等功效。

目前，国内外针对柠檬精油提取工艺及香气成分研究较多，Lota等[11]分析了9种柠檬果皮精油的香气成分，主成分分析表明所测定的9个样品可分为柠檬烯型、柠檬烯/β-蒎烯/γ-松油烯型和柠檬烯/乙酸芳樟酯/芳樟醇型。何朝飞等[12]采用HS-SPME-GC-MS对“北京”柠檬、粗柠檬、“尤力克”的香气成分进行分析，发现不同品种柠檬香气成分存在一定差异，此外，柠檬品质差异除了受环境影响外，基因型起决定性作用。涂勋良等[13]采用水蒸气蒸馏法提取并结合GC-MS对柠檬8个品种香气成分进行了比较分析，发现含量较高成分有柠檬烯、α-松油醇、γ-松油烯等，其中共有成分24种，共有成分含量间的差异和特异成分决定了8 个不同品种柠檬香气的差异，也可作为区分品种的重要特征。贺红宇等[14]采用GC/MS分析有机溶剂法、水蒸气蒸馏法和压榨方法提取柠檬精油成分，发现3种方法提取柠檬精油的成分以萜烯类、醇类、醛类和酯类为主，且含量存在显著差异。

试验在前人研究的基础上，以云南大理、保山、德宏、红河产“云柠1号”柠檬为研究对象，采用压榨法提取柠檬油结合GC/MS对其成分进行了对比分析，经质谱检索后，匹配度结合保留指数对其定性，较好地鉴别了同分异构体或同系物，避免了在定性过程中出现误判，提高定性的准确性。另外，通过对云南不同产地“云柠1号”压榨柠檬油成分系统研究，为其在药品和化妆品等领域应用提供了指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

柠檬：2017年8月至10月，根据云南大理、保山、德宏、红河4个产地的新鲜“云柠1号”柠檬成熟情况，适时采摘适量成熟果实样品，带回实验室-20 ℃保鲜贮藏。

二氯甲烷、甲醇、正己烷，GR级，由百灵威科技有限公司提供；正构烷烃C7-C30：Sigma-Aidrich公司提供。

1.1.2 仪器与设备

Agilent7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪+自动进样器（美国安捷伦科技有限公司）；压榨机（新乡市新源机械有限公司）；H2050R高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；万分之一电子天平（瑞士Mettler Tloede公司）；10 mL移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 柠檬油提取方法

参照文献[15]方法，将云南不同产地“云柠1号”柠檬鲜果洗净，放入压榨机中压榨，用分液漏斗收集流出的初油。初油静置20 min，取上层油放入离心机中于5 000 r/min条件下离心10 min，获得5种柠檬油备用。

1.2.2 柠檬油成分分析

准确称取柠檬油0.20 g，用甲醇：二氯甲烷（体积比为1∶4）混合溶液稀释到10 mL，用0.45 μm有机相滤膜过滤，直接进GC/MS分析。色谱条件：DB-5ms毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（纯度为99.999%），流速：1.0 mL/min。升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min；以4 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持20 min。进样口温度：250 ℃，进样量：1.0 μL，分流比：20∶1，溶剂延迟6 min。质谱条件：电轰击电离（EI）源；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离能量：70 eV；传输线温度：280 ℃；扫描范围（m/z）：40~450，质谱检索图库：NIST谱库。

1.2.3 定性方法

移取正构烷烃C7-C30标准品，用正己烷溶液将其稀释成质量分数为5%溶液，按照1.2.2仪器操作条件进样，求出正构烷烃C7-C30保留时间，为下一步计算柠檬油中各成分保留指数作准备。

根据Vanden Dool和Kratz的线性程序升温的保留指数原理，利用自编软件求得保留指数（KI）值：

式中：tR为保留时间，下标χ表示待分析化合物，下标n和n+1分别表示正构烷烃的碳原子数。

样品柠檬油经过GC/MS分析后，利用仪器自带NIST质谱库对柠檬油中化学成分进行自动检索，然后通过自我开发的保留指数软件求出各成分保留指数，将软件计算的保留指数与ESO精油数据库中保留指数进行比对（可接受误差不超过3%），对其进行定性。

1.2.4 定量方法

样品柠檬油经过GC/MS分析后，采用色谱峰面积归一化法计算得出各化学成分相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 柠檬油成分分析

云南不同产地“云柠1号”压榨柠檬油经GC/MS检测所得到总离子流色谱图见图1~图4，其结果采用Nist 11进行检索后结合ESO香精保留指数进行对比对其定性，利用面积归一化法计算得出柠檬油中各成分相对百分含量，结果见表1所示。

图1 大理“云柠1号”柠檬油气相色谱/质谱总离子流色谱图

图4 红河“云柠1号”柠檬油气相色谱/质谱总离子流色谱图

表1 GC/MS方法对不同产地“云柠1号”柠檬油成分的定性结果

接表1

图2 保山“云柠1号”柠檬油气相色谱/质谱总离子流色谱图

图3 德宏“云柠1号”柠檬油气相色谱/质谱总离子流色谱图

通过质谱库检索和人工图谱解析，结合保留指数比对，从云南大理、保山、德宏、红河“云柠1号”压榨柠檬油中共鉴定60个化合物，其中从大理柠檬油中共鉴定30个化合物，占总峰面积的96.58%，保山柠檬油中共鉴定42个化合物，占总峰面积的95.66%，德宏柠檬油中共鉴定30个化合物，占总峰面积的93.13%，红河柠檬油中共鉴定34个化合物，占总峰面积的95.31%。由表2可见，同一品种云南不同产地的5种压榨柠檬油中化合物种类及相对含量间存在差异。

表2 不同产地 “云柠1号”柠檬油成分类别及相对含量

2.2 柠檬油挥发性特征成分及含量分析

云南不同产地的“云柠1号”压榨柠檬油均含有桧烯、β-蒎烯、月桂烯、α-松油烯、柠檬烯、(Z)-β-罗勒烯、(E)-β-罗勒烯、γ-松油烯、萜品油烯、(E)-香芹醇、橙花醛、香芹酮、柠檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香叶酯。该15个共有成分分别占云南大理、保山、德宏、红河“云柠1号”压榨柠檬油总峰面积的94.16%，89.73%，89.21%和92.82%，存在一定差异。其中大理柠檬油特有成分为环小茴香烯，占总峰面积的0.14%，保山柠檬油特有成分为(E)-水合桧烯、对伞花烃-8-醇，分别占总峰面积的0.31%和0.03%，德宏柠檬油特有成分为辛醛、δ-3-蒈烯、对异丙烯基甲苯、葑醇、(E)-对䓝-2, 8-二烯-1-醇、(Z)-对䓝-2, 8-二烯-1-醇、香茅醇、甲酸香茅酯、十二醛，分别占总峰面积的0.70%，0.22%，0.03%，0.03%，0.05%，0.77%，0.33%和0.06%，红河柠檬油特有成分为(E)-β-松油醇，占总峰面积的0.26%，共有成分种类表明云南不同产地的“云柠1号”压榨柠檬油成分具有一定的相似性，而共有成分含量差异和特异成分表明种4种“云柠1号”压榨柠檬油成分具有一定差异。

2.3 保留指数在定性鉴定中的应用

通过质谱库检索，结合ESO精油数据库辅助定性，提高了天然化合物定性准确性，减少了误判和错判。对检索出60种化合物进行定性分析时，发现许多萜烯类、醇类等化合物，若仅用质谱库检索定性会难以判定甚至误判，尤其是同系物和同分异构体的确定[17]。

如表1所示，需确认化合物为α-松油烯，根据质谱相似度定性结果显示，几种同分异构体的匹配度都很高，无法准确区分，经比对保留指数库可知上述α-松油烯、γ-松油烯、δ-杜松烯保留指数分别为1 015，1 063和1 524，根据实测保留指数1 019，可判断化合物应为α-松油烯。此外，β-蒎烯、β-没药烯、α-水芹烯等化合物定性同样须经保留指数辅助方可确认。通过质谱库检索结合保留指数法，可准确判定柠檬油成分。

3 讨论

萜烯类化合物是柑橘水果精油中最主要成分，主要包括柠檬烯、桧烯、月桂烯、β-蒎烯、γ-松油烯等，其中柠檬烯在云南不同产地的“云柠1号”压榨柠檬油中含量最高（47.78%~65.19%），该研究结果比Lota等[11]、何朝飞等[12]对柠檬烯含量报道高，低于朱春华等[18]、贺红宇等[14]对柠檬烯含量报道，柠檬烯含量差异可能与栽培地理环境、材料选取、提取方法等[19-20]有关。另外，桧烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、萜品油烯含量与产地密切相关，其中桧烯在保山柠檬油中含量最高达到3.01%，而在德宏柠檬油中只占0.74%，为后者的3.01倍；β-蒎烯德宏柠檬油含量最高达到14.56%，在红河柠檬油中占10.26%；γ-松油烯在大理柠檬油中含量最高达到12.84%，而在德宏柠檬油中占9.22%；月桂烯在德宏柠檬油含量最高达到2.34%，而在大理柠檬油中含量占1.76%，萜品油烯德宏柠檬油中含量最高，达到1.40%。

含氧类化合物主要有醛类、酯类、醇类和酮类等化合物，其中醛类主要包括柠檬醛、橙花醛，大理柠檬油中柠檬醛含量最高达到2.09%，而保山柠檬油中柠檬醛含量仅含0.04%；德宏柠檬油中橙花醛含量最高达到1.27%，而德宏柠檬油中橙花醛含量占0.03%。

酯类主要是乙酸橙花酯和乙酸香叶酯，其中乙酸橙花酯在保山柠檬油中含量最高达到1.01%，瑞丽柠檬油中占0.51%，云南4个不同产地的柠檬油中乙酸香叶酯含量均未达到1%，相对含量为0.05%~0.82%；醇类和酮类含量和种类都不多，醇类化合物主要包括芳樟醇、4-松油醇、α-松油醇等，瑞丽柠檬油中醇类化合物含量总量最高达1.65%，大理柠檬油中醇类化合物含量占0.34%，为后者的3.85倍；酮类化合物含有香芹酮、葑酮等，大理柠檬油酮类化合物含量最高达到1.79%，红河柠檬油酮类化合物含量仅为0.02%。

4 结论

研究采用GC/MS结合保留指数对云南4个产地的“云柠1号”压榨柠檬油成分进行对比分析，共鉴定60种化合物，其中大理、保山、德宏、红河、瑞丽柠檬油中分别鉴定30，42，30和34种成分，各占峰面积总量的96.58%，95.66%，93.13%和95.31%。主要成为为桧烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯、柠檬醛、乙酸橙花酯、乙酸香叶酯等，其中共有成分15种，共有成分含量间的差异和特异成分决定了云南4个产地的“云柠1号”压榨柠檬油成分的差异。该研究为其在药品和化妆品等领域应用提供了指导。