螺旋藻藻蓝蛋白的纯化及其水饮料稳定性

王天石，吴紫涵，张少斌*，李泉智

沈阳农业大学生物科学技术学院（沈阳 110866）

螺旋藻（Spirulina）是一种丝状微藻，是地球上最古老的原核生物之一。螺旋藻已被广泛应用于食品、饲料、化妆品、污水治理等领域[1]。藻蓝蛋白是蓝藻、红藻的主要光合作用蛋白，在螺旋藻中含量高达干重的10%~20%，含有全部8种必需氨基酸[2]。藻蓝蛋白呈现靓丽的天蓝色，并能发射红紫色荧光，是一种天然蛋白质色素和荧光染料[3]。藻蓝蛋白还具有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等[4]。

随着我国经济的发展和社会生活水平的不断提高，包装饮用水、果蔬汁饮料等逐渐流行起来[5-6]。植物蛋白饮料迎合了人们对天然和健康食品的追求，年均复合增长率超过20%，发展潜力巨大[7-9]。螺旋藻藻蓝蛋白不仅具有重要的营养保健价值，而且是一种天然色素，因此研究藻蓝蛋白饮料具有重要的理论与应用价值。

温度、柠檬酸等各种物理化学因素都会影响藻蓝蛋白的稳定性[10-12]。已有的研究大都以磷酸缓冲液为溶剂，与直饮饮料有较大差异，此外，多以藻蓝蛋白粗提取液为试验材料，由于部分杂蛋白容易变性沉淀，影响饮料的外观和品质。因此，此次试验将纯化的藻蓝蛋白加入到包装饮用水中，调制成藻蓝蛋白水饮料，并综合分析温度、光强等对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响，为藻蓝蛋白水饮料的食用推广提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

钝顶螺旋藻直线型突变株SP-Dz[13]（实验室保存）；羟基磷灰石（分析纯，珠海嘉亿生物科技有限公司）。

1.1.2 仪器与设备

Unico2100型分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；F4500荧光分光光度计（日本日立公司）；HPG-280BX型光照培养箱（上海四科仪器设备有限公司）；J-HH-6A精密数显恒温水浴锅（上海胜卫电子科技有限公司）；FA1004型天子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻培养

将纯化的螺旋藻藻种接种在Zarrouk氏培养液中，接种浓度A560=0.3~0.5，置于温室内光照培养，每天搅动3次，当螺旋藻处于旺盛生长期（A560=1.5~2.0）时用滤网采收，收获的藻泥置于-20 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2 藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定

将藻泥装入小烧杯中称其质量，按照20 mL/g的量加入0.01 mol/L CaCl2水溶液，置于冰箱中反复冻融2~3次。经10 000g离心10 min，弃去沉淀，得到藻蓝蛋白的粗提液。将藻蓝蛋白粗提液进行透析、过羟基磷灰石层析柱，利用分光光度计分别测定A620，A650和A280吸光度，绘制洗脱曲线，以A620/A280计算藻蓝蛋白纯度，并测定藻蓝蛋白吸收光谱和荧光光谱。藻蓝蛋白溶液经冷冻干燥，得到藻蓝蛋白干粉，低温保存。试验前，将适量藻蓝蛋白干粉加入饮用纯净水，充分溶解后离心去沉淀，得到的藻蓝蛋白溶液用于藻蓝蛋白水饮料稳定性研究。

1.3 藻蓝蛋白水饮料稳定性研究

1.3.1 保存时间和蛋白浓度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

将藻蓝蛋白溶液与饮用纯净水按一定比例混合，分别测定A620值和A650值，根据经验公式计算藻蓝蛋白的质量浓度[15]：藻蓝蛋白质量浓度=（A620-0.474×A650）/5.34，见表1。将不同浓度的藻蓝蛋白水饮料分别分装多个试管，每一处理重复三个，分别放置在室温、暗处，每12 h测定一次A620值，共测定48 h。同时观察水饮料是否有颜色变化和沉淀产生。用不同时间测定的A620值除以起始A620值，再乘以100%，表示藻蓝蛋白水饮料在不同保存时间条件下的相对稳定性。

表1 藻蓝蛋白水饮料光吸光度与蛋白质质量浓度

1.3.2 温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

取纯化的藻蓝蛋白与饮用纯净水按一定比例混合，调节混合溶液的A620值在0.6~0.7，混匀后测定起始A620值，分装在若干试管中，每管3 mL，试管上端加塞密封，避光，分别置于室温（26 ℃），水温1，37，50和65 ℃的恒温水浴锅中，持续保温180 min，每隔30 min测定1次A620值，并观察是否有颜色变化和沉淀产生。

1.3.3 光强对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

取纯化的藻蓝蛋白，与饮用纯净水按一定比例混合，调节混合溶液的A620值在0.6~0.7，混匀后测定起始A620值，分装在若干试管中，每管3 mL，试管上端加塞密封。分别置于室内暗处（光照强度小于10 Lux）、室内亮（光照强度约100 Lux）、光照培养箱（光照强度约10 000 Lux），放置180 min，每隔30 min测定1次A620值，以室内散射光样品A620值和光照培养箱内样品A620值分别除以室内暗处样品的A620值，再乘100%，表示藻蓝蛋白水饮料在不同光照强度条件下的相对稳定性。

1.3.4 藻蓝蛋白稳定性多因素试验

取纯化的藻蓝蛋白，与饮用纯净水按一定比例混合，调节混合溶液的A620值在0.6~0.7，混匀后测定起始A620值，分装在若干试管中，每管3 mL，试管上端加塞密封。基于单因素试验结果，以光强、温度和时间设计三因素三水平正交试验，因素水平见表2，试验设计见表3。将上述试管分别置于表3中所示9个试验条件下，试验结束时测定A620值，根据A620值下降的程度判断藻蓝蛋白水饮料的稳定性。

表2 因素水平表

表3 藻蓝蛋白水饮料多因素试验正交设计表

2 结果与分析

2.1 螺旋藻藻蓝蛋白的纯化与光谱分析

新鲜的螺旋藻藻泥在氯化钙溶液中悬浮，反复冻融3次后离心，得到藻蓝蛋白粗提液，其纯度为0.611，远高于超声波法破碎藻细胞提取藻蓝蛋白的纯度[14]。透析除去粗提液中的盐离子，使用羟基磷灰石吸附层析柱进行纯化，洗脱曲线如图1所示。第一个洗脱峰A的最大光吸收波长为280 nm，为1 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱下的杂蛋白，第二个洗脱峰B的最大吸收波长为620 nm，为20 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱下的藻蓝蛋白，第三个洗脱峰C的最大吸收波长为650 nm，为100 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱下的别藻蓝蛋白。在洗脱峰B中，藻蓝蛋白最高纯度超过4.5，合并30~40 mL之间的洗脱液，得到的藻蓝蛋白纯度为4.2，约为藻蓝蛋白粗提液纯度的7倍，高于多数已有报道[15]，同时简化纯化过程，有利于藻蓝蛋白的规模化生产与应用。

图1 羟基磷灰石柱层析纯化藻蓝蛋白

光谱分析是定性定量检测藻蓝蛋白的主要手段[16]。藻蓝蛋白的吸收光谱如图2所示。最大吸收峰在618 nm，溶液为天蓝色。藻蓝蛋白的荧光激发光谱和荧光发射光谱如图3所示。最大荧光激发波长为618 nm，最大荧光发射波长为639 nm，为红紫色荧光，与已有报道相近[17]，表明纯化的藻蓝蛋白保持了其天然结构与光学特性。将藻蓝蛋白添加到包装饮用水中制成藻蓝蛋白水饮料，不仅赋予水饮料营养和保健价值，而且使饮料呈现靓丽的天蓝色，作为天然蛋白质色素，同样具有广泛应用价值。

图2 藻蓝蛋白的吸收光谱

图3 藻蓝蛋白的荧光光谱

2.2 保存时间和蛋白质量浓度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

不同浓度藻蓝蛋白水饮料A620值随保存时间的变化如图4所示，相对稳定性如图5所示。藻蓝蛋白水饮料随着保存时间延长，A620值下降，不同质量浓度藻蓝蛋白水饮料A620值下降趋势基本相同。在0~12 h之内，A620值下降迅速，降至初始值的50%以下，饮料蓝色变浅，其中：0.112 mg/mL的藻蓝蛋白水饮料最稳定，降至初始值的49%；0.087 mg/mL的藻蓝蛋白水饮料稳定性最低，降至初始值的35%。在12~36 h，A620值下降缓慢，藻蓝蛋白较为稳定，不同质量浓度藻蓝蛋白水饮料稳定性差异较小，均降至初始值的30%左右。36 h之后，藻蓝蛋白水饮料A620值又迅速下降；在48 h时，A620值降至初始值的20%以下，此时藻蓝蛋白水饮料仍为淡蓝色；60 h之后，饮料几乎失去蓝色，并有少量沉淀产生。以上结果表明，纯水对藻蓝蛋白稳定性影响较大，纯水与藻蓝蛋白提取缓冲液的pH均在7.0左右，没有明显差别，两者的主要区别在于离子强度，缓冲液含有约0.9%的氯化钠，低浓度盐离子能提高蛋白质溶解度、促进蛋白质胶体溶液稳定[18]。纯水中盐离子浓度很低，藻蓝蛋白表面失去电荷排斥作用，藻蓝蛋白容易形成聚集体，溶解度下降，导致光吸光度降低。

图4 藻蓝蛋白质量浓度和保存时间对水饮料稳定性的影响

图5 藻蓝蛋白质量浓度和保存时间对水饮料相对稳定性的影响

2.3 温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响见图6。温度在15，26和37 ℃时，3 h内，其A620值基本无变化，表明此温度条件下藻蓝蛋白水饮料非常稳定。当温度为50 ℃时，随着时间延长，藻蓝蛋白水饮料A620值逐渐下降，每30 min下降约4%，3 h下降约24%，溶液仍为澄清透明。当温度达到65 ℃时，A620值迅速下降，蓝色变浅，并出现浑浊现象，表明在此温度下藻蓝蛋白迅速变性并沉淀。藻蓝蛋白在水中的稳定性低于其在碳酸饮料中的温度稳定性[19]，原因可能是饮料中的各种添加剂对藻蓝蛋白具有一定的保护作用。上述结果表明，藻蓝蛋白水饮料的配制和保存尽可能在低温条件下，而饮用温度最好低于50 ℃。

图6 温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

2.4 光照强度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响

由图7可见，相对于暗处，光照越强，A620值下降越多，与藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性相似[20]。但总体下降幅度均很小，即使在强光照（10 000 Lux）条件下，3 h时A620值下降也不到5%。以上结果表明，光照强度越低，藻蓝蛋白水饮料越稳定，短时间（3 h）内光照强度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响较小。

2.5 藻蓝蛋白水饮料多因素稳定性研究

多因素试验结果见表4。根据不同处理A620下降值可以看出，处理1条件下藻蓝蛋白水饮料最稳定。根据K值可以看出，温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响最大，其次是保存时间，而光照强度的影响最小，这与藻蓝蛋白在碳酸饮料中的稳定性相同[19]。根据每个因素平均值x，螺旋藻最佳保存条件为A1B1C1。统计分析表明，温度和时间对藻蓝蛋白稳定性的影响差异达到极显著水平，光照强度之间的差异为显著水平。

表4 藻蓝蛋白水饮料稳定性试验正交设计与结果

3 结论

试验采用冻融法获得螺旋藻粗蛋白，进一步采用羟基磷灰石吸附层析纯化获得藻蓝蛋白，其纯度为4.2，最大吸收波长为618 nm，最大荧光发射波长为639 nm。将藻蓝蛋白与饮用纯净水混合，制得天蓝色、澄清透明的藻蓝蛋白水饮料。单因素试验表明，藻蓝蛋白水饮料稳定性受到藻蓝蛋白浓度和光照强度的影响很小。温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性的影响最大。37℃及其以下温度条件下，藻蓝蛋白水饮料非常稳定，3 h内A620没有明显变化。温度为50 ℃时，藻蓝蛋白水饮料3 h内A620下降不到25%。温度升高到65 ℃时，藻蓝蛋白水饮料A620迅速下降，藻蓝蛋白变性沉淀，溶液浑浊。在室温、避光条件下，藻蓝蛋白水饮料可以保持较长时间，在36 h保存时间内A620值仍保持在初始值的30%左右，溶液仍为澄清靓丽的天蓝色。多因素试验表明，温度对藻蓝蛋白水饮料稳定性影响最大，其次为保存时间，影响最小的为光照强度。藻蓝蛋白水饮料稳定性最佳条件为室内暗、室温26 ℃、保存时间30 min。综合以上结果，藻蓝蛋白水饮料应在低温、弱光条件下配制和保存，饮用温度最好在50 ℃以下。