天麻总酚闪式提取工艺研究及含量测定

杨云，蔡朝霞*

华中农业大学食品科技学院（武汉 430070）

天麻（Gastrodia elata）是兰科天麻属多年生草本寄生植物，主产于我国云南、贵州、四川等地，其中云南昭通和贵州毕节的天麻堪称为道地药材。天麻块茎在我国已经有2 000多年的药用历史，是重要的药食两用材料，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，可用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、头痛眩晕、肢体麻木等病症[1]。天麻具有丰富的酚性成分，除天麻素（4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷）是天麻的主要有效成分之外，还包括对羟基苄醇、对羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醇、香草醛、香兰素等酚类化合物[2-7]。天麻素和对羟基苯甲醇含量是《中国药典》2015年版中天麻质量标准制定的重要的参考指标。文献报道，抗氧化、抑制早期炎症反应、减轻脑缺血损伤、保护神经细胞的活性作用是天麻酚性成分共同作用的结果，因此使用天麻总酚含量作为评价天麻质量的指标或更为全面。

天麻酚类成分的传统提取方法以水煎煮为主，其他提取方法有酶法、超声法、超高压等[8]。孙海燕[3]采用超声法提取天麻总酚的含量，得到的总酚含量为5.62 mg/g；朱素英[9]采用57%的乙醇水浴提取天麻总酚，得到的总酚含量达44.96 mg GAE/g；田孟华等[2]采用40%乙醇超声提取得到天麻总酚含量为4.47 mg/g。丁慧等[10]采用82%的乙醇，使用超高压技术提取天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量为718.69 μg/g。但是上述提取方法多存在提取时间长、有机溶剂使用多、对设备要求高等缺陷。闪式提取器[11]是根据组织破碎原理而设计的一种新型提取器，它将高速组织粉碎机和匀浆机等机械设备优势很好地结合在一起，被广泛应用于中草药及其他植物成分的提取。利用高速液体破碎、高速研磨、高速搅拌和超分子渗滤技术，在常温液体状态下数秒至几分钟内把植物组织破碎、研磨至细微颗粒状，通过细胞组织的破裂和组织外围溶剂的快速渗透与包容，使组织内有效成分分子迅速解离并进入到溶剂体系中，并迅速实现药材组织内外有效成分分子浓度的平衡，达到快速提取的效果。此次试验以天麻粗粉为原料，使用中草药组织破碎提取机器，研究天麻总酚的闪式提取工艺，并与煎煮法、超声乙醇提取法和水浴提取法得到总酚的含量进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验器材

中草药组织破碎提取器（ATS-150012A，北京金鼐科技发展有限公司）；高速万能粉碎机（FW100，天津市泰斯特仪）；电子分析天平（BSA124S，赛多利斯茵泰科公司）；紫外分光光度计：Nanodrop 2000C，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；台式高速冷冻离心机（SIGMA 3-30K，德国西格玛离心机公司）；数显恒温水浴锅（HH-2，常州国华电器有限公司）；超声波内频清洗机（SD-500DTY，宁波新芝生物科技有限公司）。

1.1.2 材料

天麻饮片由武汉健民有限公司提供，产地是云南昭通。

1.1.3 试剂

无水乙醇（AR）；Folin-酚试剂（AR），广州飞扬生物工程有限公司；无水碳酸钠（AR），国药集团化学试剂有限公司；没食子酸标准品（纯度＞99%），上海源叶生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 总酚测定方法

采用Folin-酚比色法，参考文献[3]的方法并略做修改。精密称取0.500 0 g没食子酸标准品于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度；准确吸取0.0，0.1，0.2，0.3，0.5和1.0 mL上述溶液并分别定容至10 mL，另取6支试管，分别吸取0.1 mL上述溶液，各加5 mL水，混合，加入0.5 mL Folin-酚试剂，振荡混匀后；反应6 min后，加入1.5 mL 20%碳酸钠溶液，混合均匀后加入水定容至10 mL，在37 ℃水浴中避光静置30 min，在765 nm波长下测定其吸光度，以没食子酸质量浓度x为横坐标，吸光度y为纵坐标，制作标准曲线，得回归方程y=0.678 9x+0.055 1（R2=0.999），在0.00~0.50 mg/mL范围内，吸光度与质量浓度线性关系良好。根据吸光度和标准曲线方程计算样品中总酚含量。天麻总酚含量（Y，mg GAE/g）按式（1）计算。

式中：C为天麻总酚质量浓度，mg/mL；v为提取液定容后的体积，mL；m为天麻样品的质量，g。

1.2.2 单因素试验

以不同体积分数的乙醇作为提取溶剂，准确称取过20目筛（850 μm）的天麻样品粉，参考文献[12-15]和已有试验工作基础上，以提取时间、料液比和乙醇体积分数3个因素的水平值为研究对象。在提取时间4 min、乙醇体积分数0的条件下进行闪式提取，提取料液比分别为1∶40，1∶45，1∶50，1∶55和1∶60（g/mL），考察提取料液比对天麻中总酚得率的影响；在提取料液比1∶45（g/mL）、提取时间4 min的条件下进行闪式提取，乙醇体积分数设定为0，20%，40%，60%和80%，考察乙醇体积分数对天麻总酚得率的影响；在提取料液比1∶45（g/mL）、乙醇体积分数0的条件下进行闪式提取，提取时间分别为1，2，3，4和5 min，考察提取时间对天麻总酚得率的影响。提取液均经8 000 r/min离心15 min，吸取0.2 mL上清液，按1.2.1小节方法进行检测。

1.2.3 正交试验设计

在单因素的基础上，应用SPSS 21.0软件，设计三因素三水平的正交优化试验，以天麻提取液中总酚得率为评价指标，确定闪式提取天麻总酚的最佳提取条件。正交试验因素与水平设计见表1。

表1 天麻总酚闪式提取工艺正交试验因素水平

1.2.4 天麻总酚提取方法的比较研究

取3份经粉碎过20目筛（850 μm）的天麻样品粉，分别4种提取方法提取天麻总酚。其中，60 ℃水浴提取条件为料液比1∶30（g/mL）、提取时间2 h；闪式提取条件为提取时间2 min、料液比1∶40（g/mL），纯水提取；超声提取条件为料液比1∶10（g/mL）、提取时间2 h、70%乙醇的提取溶剂；煎煮法条件为8倍水提取、提取时间2 h。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间的影响

由图1可知，在1~5 min，天麻提取液中总酚得率随着提取时间的延长而增加。提取时间大于3 min之后，提取液中总酚得率下降，推测可能是由于提取时间延长导致天麻细胞破壁，淀粉等成分溶出与水接触，阻碍了酚类成分的溶出，或是提取液温度的上升导致多酚类物质的氧化加快，从而导致总酚得率下降。

图1 提取时间对天麻总酚提取的影响

2.1.2 料液比的影响

由图2可知，料液比在1∶40~1∶55（g/mL）范围内，天麻提取液中总酚得率之间没有显著性（p＞0.05）。当料液比达到1∶60（g/mL）时，天麻提取液中多酚得率有显著降低。颗粒物料处于合适的溶液体积范围内，提取料液比的增加对天麻总酚成分溶出没有明显差别，但随着提取溶剂的体积继续增加，总酚得率下降。

图2 料液比对天麻总酚提取的影响

2.1.3 乙醇体积分数的影响

由图3可知，乙醇体积分数在0~80%范围内，天麻提取液中总酚得率随着乙醇体积分数的升高而减少，乙醇体积分数为0和20%时，提取液中总酚得率几乎相近，没有显著性（p＞0.05）。但随着乙醇体积分数继续增加（20%~80%），天麻总酚含量开始下降。推测原因是天麻素等酚性成分是水溶性的，但天麻属于根茎类药材，含有淀粉和多糖类成分，水提液杂质较多，对后续提纯处理带来很大困难，所以选择乙醇作为提取溶剂，但是高体积分数的乙醇会导致一些醇溶性杂质或者是脂溶性强的成分溶出增加，这些物质的溶出导致酚类成分从颗粒物料中的溶出减少，所以采用低体积分数乙醇作为天麻中天麻素等酚类成分的提取溶剂较为合适。

图3 乙醇体积分数对天麻总酚提取的影响

2.2 正交试验

由表2中R值可知，因素A（提取时间）对闪式提取影响最大，各因素对总酚提取的影响顺序为A＞C＞B。但方差分析显示三因素对闪式提取的影响均不显著，再考虑到天麻水提液杂质较多，故采用乙醇作为提取溶剂，且采用低体积分数乙醇作为天麻中天麻素等酚类成分的提取溶剂较为合适。因此，最佳提取因素的组合为A1B1C2，即提取时间2 min，料液比1∶40 g/mL，乙醇体积分数20%。

表2 天麻总酚闪式提取正交试验表及结果分析

准确称取3份粉碎过20目筛（850 μm）的天麻样品粉，按照最佳提取组合条件进行验证性试验，结果显示提取液总酚的平均含量为35.25 mg GAE/g，与优化试验中含量最高提取条件组的很接近，说明优化后的最佳提取条件稳定性很高。

表3 天麻总酚闪式提取方差分析表

2.3 天麻总酚提取方法的比较

将闪式提取方法与文献报道的3种天麻总酚提取方法进行比较研究，提取结束后分别测定提取液的天麻总酚得率，结果如图4所示。由图4可知，4种方法提取天麻总酚的效率不同，差异较大，以闪式提取法的提取率最高，煎煮法的最低。闪式提取法的提取率较煎煮法的提高了129.40%，较60 ℃水浴提取、超声提取分别提高了82.26%和31.20%。对于天麻总酚提取而言，煎煮法和水浴提取时间长，超声提取消耗乙醇等有机溶剂；而闪式提取法提取时间短，而且能够最大限度地保护提取总酚的活性，提取效率高，密闭环境操作，安全系数高。

图4 4种提取方法提取天麻总酚得率的比较

3 结论

闪式提取器具有高速搅拌、高速破碎、高速研磨、高速匀浆的优点，在中药材等植物提取物领域适用性强，适合植物根、茎、叶、花等软硬材料的快速提取。此次试验运用闪式提取法提取天麻总酚，其最佳提取工艺条件为提取时间2 min、料液比1∶40（g/mL）、乙醇体积分数20%，在此条件下天麻提取液中总酚得率达到35.25 mg GAE/g。与传统煎煮法相比较，该方法提取时间大大缩短，耗费机械功率减低，是一种节能高效的提取天麻总酚成分的方法。