蒸汽爆破预处理优化苹果渣多酚提取及抗氧化

范祺，张明，张博华，杨立风，王崇队，马超*

中华全国供销合作总社济南果品研究院（济南 250014）

苹果渣是新鲜苹果经破碎压榨提汁后的剩余物，主要由果皮、果核和残余果肉组成，含有可溶性糖、维生素、矿物质及纤维素等丰富的营养物质，是良好的饲料资源[1]。随着农业循环经济和苹果产业可持续发展观点的提出，近年来从苹果果汁废弃物和苹果工业废弃物中提取苹果多酚成为研究重点，苹果多酚具有很强的抗氧化作用，且其抗氧化活性因苹果的成熟度、品种和生长环境等因素的不同而有所区别[2]。目前从苹果中提取多酚研究比较广泛，但是对于苹果渣的开发利用研究较少。因此针对苹果渣多酚的开发利用，对于实现废弃物的再利用和环境保护都有重要的意义。

当代食品功能因子的开发与利用多结合新型技术来实现高效提取，其中超声波、微波具有设备简单、适用范围广、提取效率高、省时、节省试剂等特点，被广泛应用于天然产物活性成分的提取研究[3-5]。但是一种技术的独立应用，对活性成分提取得率的提升有限，需要将几种提取方式联合起来，才能充分发挥几种技术的优势[6]。这几年蒸汽爆破技术在食品行业的应用越来越广泛，在活性成分的提取方面的应用也越来越多[7]。

蒸汽爆破即汽爆（steam explosion），是应用蒸汽弹射原理实现爆炸过程对生物质进行预处理的一种技术。蒸汽爆破是将物料置于高压密闭环境中，利用过热蒸汽将物料加热到较高的温度，在一定压力下保持数秒或数分钟后瞬间泄压，随着压力骤降、水分汽化，物料产生爆破效应的一种物理处理方法[8]。植物细胞中的纤维为木素所粘结，与高温、高压蒸汽作用下，纤维素结晶度提高，聚合度下降，半纤维素部分降解，木素软化，横向连结强度下降，甚至软化可塑[9]。当充满压力蒸汽的物料骤然减压时，孔隙中急剧膨胀，产生“爆破”效果，可部分剥离木素，使其通透性变强，更利于多酚黄酮类活性物质的提取。

以蒸汽爆破为前处理技术，联合微波和超声等提取技术，优化蒸汽爆破提取多酚的条件，联合3种提取技术，获得多酚提取率的最大值，并研究3种提取技术对苹果渣多酚抗氧化活性的影响，为苹果渣废物的重新利用、减少环境污染提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣（烟台安德利有限公司）；福林酚、没食子酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、DPPH（上海麦克林有限公司）；甲醇、无水乙醇、硫酸铁、水杨（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

ME204E/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SHA-B型恒温水浴摇床（江苏杰瑞尔电器有限公司）；QBS-80型蒸汽爆破设备（鹤壁政道启宝实业有限公司）；Vortex-3型旋涡混合仪（上海嘉鹏科技有限公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WZD4S-01微波真空设备（南京三乐微波技术发展有限公司）；SB-1100型水浴锅、N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；UV1000型单光束紫外/可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

选取一定量的苹果渣，按照一定比例添加去离子水，充分混合，放置过夜，待用。

1.3.2 苹果渣多酚提取工艺流程苹果渣→预处理→汽爆处理→烘干打粉→多酚提取→提取方式优化→离心浓缩→多酚提取液

1.3.3 没食子酸标准曲线绘制

采用Folin-Ciocalteus法[10]，回归方程为y=0.040 9x+

0.054 3，R2=0.999 6。

1.3.4 提取溶剂对苹果渣多酚得率的影响

分别以纯水、50%乙醇、乙醇、50%甲醇、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯作为提取溶剂，料液比为1∶30（g/mL），静置30 min，离心处理（3 000 r/min，5 min），过滤上清液，定容至50 mL，即得不同溶剂提取液。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 复水率对苹果渣多酚提取率的影响

设定复水率30%，50%，70%和90%，汽爆稳压时间90 s，汽爆压力0.9 MPa，对苹果渣进行预处理，收集汽爆后的样品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，经离心、过滤、浓缩，得到苹果渣提取物。

1.3.5.2 蒸汽爆破稳压时间对苹果渣多酚提取率的影响

设定蒸汽爆破稳压时间30，60，90，120，150和180 s，汽爆压力0.9 MPa，对苹果渣进行预处理，收集汽爆后的样品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，经离心、过滤、浓缩，得到苹果渣提取物。

1.3.5.3 蒸汽爆破压力对苹果渣多酚提取率的影响

设置蒸汽爆破压力0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 MPa，稳压时间90 s，对苹果渣进行预处理，收集汽爆后的样品，放置烘箱于70 ℃烘干8 h。用50%乙醇按料液比1∶30（g/mL）提取，经离心、过滤、浓缩，得到苹果渣提取物。

1.3.6 正交试验

在单因素试验结果的基础上，选取复水率、蒸汽爆破稳压时间、蒸汽爆破压力3个因素，并取3个水平（如表1所示），以苹果渣多酚得率为指标，进行L9(33)正交试验优化，确定最佳提取条件。

表1 正交试验因素水平表

1.3.7 提取方式的优化

1.3.7.1 微波优化苹果渣多酚的提取

采用微波辅助提取法，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数50%、微波功率800 W的条件下，选择微波处理30，60，90，120和150 s，冷却至室温，经离心、过滤、浓缩，得到苹果渣提取物。利用1.3.3的方法测定多酚得率，并与汽爆处理后的样品的得率进行比较。

1.3.7.2 超声优化苹果渣多酚的提取

采用超声辅助提取法，在料液比1∶30（g/mL）、乙醇体积分数50%、超声功率800 W的条件下，选择超声处理2，4，6，8和10 min，冷却至室温，经离心、过滤、浓缩，得到苹果渣提取物。利用1.3.3的方法测定多酚得率，并与汽爆处理后的样品的得率进行比较。

1.3.8 苹果渣多酚对DPPH自由基清除作用[11]

取2 mL苹果渣提取液，加入2 mL 400 μmol/L DPPH溶液，于30 ℃暗室反应30 min，以2 mL甲醇作为空白对照，在517 nm处测定其吸光度，计算DPPH自由基清除率以及IC50值。

1.3.9 苹果渣多酚对羟自由基清除能力[12]

量取2 mL 1.8 mmol/L的FeSO4放入试管中，加入1.5 mL 1.8 mmol/L水杨酸和1 mL不同浓度样品溶液，最后加入0.1 mL 0.03% H2O2并启动整个反应，于37 ℃反应30 min，然后2 000 r/min离心10 min，以蒸馏水代替样品溶液做空白参比，在510 nm处测定吸光度。

1.3.10 苹果渣多酚还原力测定[13]

取不同量待测液加去离子水补足至1 mL，加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液和1%的铁氰化钾溶液各2 mL，混合均匀，于50 ℃保温20 min，放至室温，加入2 mL 10%三氯乙酸，混合均匀，静置10 min。取2 mL混合液，加2 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3，混合均匀，放置10 min，在700 nm下测定吸光度。同时以去离子水代替样品做空白对照。

1.4 数据处理

所有试验均重复3次，结果以“平均值±标准差”表示。方差分析使用SPSS 23.0软件分析。

2 结果与分析

2.1 提取试剂对多酚得率的影响

由图1可知，不同溶剂的提取得率具有较大差异，其中50%乙醇、50%甲醇和甲醇提取的多酚得率较高，分别为0.24%，0.20%和0.18%，纯水提取的得率最低，为0.12%，乙酸乙酯与正丁醇提取的得率接近。提取得率顺序为50%乙醇＞50%甲醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞正丁醇＞乙醇＞纯水，其原因可能是醇水混合提取液更有利于提取水溶性和醇溶性的多酚物质[14]，故选择50%乙醇为苹果渣多酚提取的最优试剂。

图1 提取溶剂对苹果渣多酚得率的影响

2.2 蒸汽爆破压力对多酚得率的影响

由图2可知，随着汽爆压力的增大，苹果渣多酚含量含量呈现出上升趋势，当蒸汽爆破压力为0.3 MPa时，得率为0.18%；当压力为0.6 MPa时，得率为0.22%；当压力为0.9 MPa时，苹果渣多酚的得率有了较大提升，为0.4%。但是当压力超过0.9 MPa后，继续增加压力对多酚得率的提升影响不明显。选择合适的汽爆压力能获得最高的多酚提取率，主要原因是蒸汽爆破处理使苹果渣紧密的纤维结构解聚，提取液更容易渗透进果皮内部，增加了果渣与提取溶剂接触面积，最终使更多的多酚溶解在提取液中，进而提高多酚的得率[15]。

图2 汽爆压力对苹果渣多酚得率的影响

2.3 蒸汽爆破稳压时间对多酚得率的影响

由图3可以看出，随着汽爆稳压时间的延长，苹果渣多酚的含量呈现增大的趋势，当蒸汽爆破稳压时间为30 s时，多酚得率变化不明显。当稳压时间为60 s时，多酚得率由0.21%增长到0.338%。当稳压时间为90 s时，多酚得率进一步提升，为0.43%。稳压时间进一步增加，多酚得率变化不明显。蒸汽爆破的工作原理是将原料置于高温、高压环境中，原料被过热液体润胀，蒸汽充满孔隙，稳压时间越长，越利于过热蒸汽充满物料内部，原料孔隙中的过热液体迅速汽化，体积瞬间膨胀导致细胞“爆破”。当稳压时间在90 s以后，内部蒸汽已经达到饱和状态[16]。但是随着时间的延长，苹果渣碳化变黑比较严重，且能源消耗比较严重，因此汽爆时间选择在90 s比较合适。

图3 汽爆稳压时间对苹果渣多酚得率的影响

2.4 复水率对多酚得率的影响

由图4可以看出，当苹果渣未加纯水调节复水率时，经汽爆处理，多酚得率为0.37%；当复水率为30%时，多酚得率略有提升，为0.41%。继续提高复水率，多酚得率变化不大。当复水率为90%时，多酚得率降低到0.34%。在蒸汽爆破之前添加一定量的纯水，调节样品的复水率，水分渗透进样品中，当汽爆处理时，样品能够充分膨胀，将内部纤维结构破坏得更充分，更有利于活性成分的溶出，但是水含量过高，汽爆过程中产生的高温会对活性成分产生破坏作用，导致活性和提取得率降低[17]。当复水率为70%时，汽爆后的样品呈现浆糊状，不利于收集和保存，因此建议复水率50%最合适。

图4 复水率对苹果渣多酚得率的影响

2.5 正交试验结果与分析

由表2的极差分析可知，试验因素对苹果渣多酚含量影响的主次顺序为B＞C＞A，即蒸汽爆破稳压时间＞复水率＞蒸汽爆破压力。由k值大小可知，优化组合为A3B3C1，即蒸汽爆破压力1.0 MPa，蒸汽爆破稳压时间100 s，复水率30%。经验证，在此条件下苹果渣多酚得率为0.43%，比汽爆前苹果渣多酚得率提高115%。

表2 试验结果与方差分析

2.6 微波处理对苹果渣多酚得率的影响

微波时间在30~120 s之间，苹果渣多酚得率与提取时间呈正相关，随着微波时间的增加，微波破坏苹果渣细胞壁的效果显著，从而使苹果渣多酚的提取得率呈上升趋势。微波时间在120 s时，苹果渣多酚提取量达到最大值，进一步增加微波时间，多酚提取量与微波时间呈反比。提取时间过短，多酚提取不完全；提取时间过长，不仅会增加能耗，而且多酚类物质的稳定性会变差，从而降低多酚得率[18]。因此，微波处理时间建议维持在120 s。

2.7 超声处理对苹果渣多酚得率的影响

苹果渣经超声处理2，4，6和8 min，多酚得率分别为0.21%，0.29%，0.38%和0.55%，处理时间在8 min内，苹果渣多酚的得率随着处理时间的延长而增加。借助超声波产生的“空化效应”，可以加速多酚的渗透速度[19]。当时间延长至10 min时，多酚的得率略有下降，为0.50%。推测是超声波长时间作用使部分多酚分子结构被破坏，导致多酚提取率降低[20]。与图5相比，超声对多酚得率的改善强于微波的改善作用。

图5 微波时间对苹果渣多酚得率的影响

图6 超声时间对苹果渣多酚得率的影响

2.8 几种方式联合对苹果渣多酚得率的影响

当几种提取方式联合后，苹果渣多酚的得率有明显的提升。未经处理的样品，经提取以后，多酚得率仅为0.2%，而经过汽爆处理，多酚得率为0.41%，是未经处理的2倍。经汽爆处理的样品多酚得率略低于超声与微波联合处理后的多酚得率0.46%。经汽爆处理，再分别进行微波和超声处理，多酚得率分别为0.58%和0.66%，说明超声对多酚的提取改善作用更强，这可能是因为超声处理过程中温度变化不大，导致多酚的活性损失较小，而微波处理则面临高温的破坏问题。经过汽爆、微波、超声三种方式联合，获得的最大多酚得率为0.81%。

图7 不同预处理方式对苹果渣多酚得率的影响

2.9 DPPH清除率

DPPH自由基是一种稳定的自由基，遇甲醇溶液显紫色，自由基清除剂能够与DPPH的单电子配对，在最大吸收波长处颜色变浅，吸光度随之变小，DPPH自由基清除率越高表明其抗氧化能力越大。苹果渣多酚具有良好的DPPH清除率。半数清除率IC50反映被测样品的抗氧化能力，数值越小，说明样品的抗氧化能力越强。由图8可以看出，未经汽爆、微波、超声处理的样品的半数清除率为196.9 μg/mL，经过气爆处理，半数清除率有明显的降低，为137.4 μg/mL。汽爆分别联合微波、超声处理，半数清除率基本接近，并且进一步降低，分别为100.11 μg/mL和98.32 μg/mL，当三种技术联合处理时，半数清除率下降至82.5 μg/mL。

图8 不同预处理方式下的DPPH半数清除率

2.10 羟自由基清除率

苹果渣多酚具有良好的羟自由基清除率。半数清除率IC50反映被测样品的抗氧化能力，数值越小，样品的抗氧化能力越强。由图9可以看出，未经汽爆、微波、超声处理的样品的半数清除率数值较大，为

图9 不同预处理方式下的羟自由基半数清除率

723.9 μg/mL，经过汽爆处理，半数清除率有明显的降低，为565.8 μg/mL。汽爆分别联合微波、超声处理，半数清除率基本接近，并且进一步降低，分别为442.1 μg/mL和459.8 μg/mL，当三种技术联合处理时，半数清除率有明显的下降，为248 μg/mL，说明经过汽爆、微波、超声联合处理，苹果渣多酚的抗氧化能力有显著的提升。

2.11 还原力测定

由图10可知，样品的总还原能力与样品浓度具有剂量关系，斜率越大，还原能力越强。还原能力最强的为经过气爆、超声和微波联合处理得到的苹果渣多酚，还原能力最弱的为空白组。微波+汽爆处理与微波+超声所得的苹果渣多酚的还原力接近，汽爆联合超声处理比只用汽爆处理所得的苹果渣多酚的还原力强。

图10 不同预处理方式下的还原力

3 结论

试验以蒸汽爆破预处理方式为研究对象，研究了不同溶剂对苹果渣多酚得率的影响。不同溶剂的提取得率顺序为50%乙醇＞50%甲醇＞甲醇＞乙酸乙酯＞正丁醇＞乙醇＞纯水。试验还研究了汽爆参数复水率、汽爆稳压时间、汽爆压力对苹果渣多酚得率的影响。当蒸汽爆破压力高于0.9 MPa时，苹果渣多酚的得率有较大提升。当蒸汽爆破稳压时间为30 s时，多酚的得率变化不明显。当复水率为50%时，可获得较大的苹果渣多酚得率。

在研究的基础上设计正交优化试验，得出苹果渣多酚提取的最佳工艺：汽爆压力1.0 MPa、汽爆时间100 s、复水率30%，此时苹果渣多酚的提取得率最高，达到0.43%，比汽爆前苹果渣多酚得率提高115%。与微波、超声等其他预处理方式进行对比，结果发现蒸汽爆破所得的苹果渣多酚的得率均高于这两种处理方式。经过汽爆、微波、超声联合处理，苹果渣多酚的得率达到最高（0.81%）。并且苹果渣多酚DPPH清除能力、羟自由基清除能力和还原力均有显著提高。总之，蒸汽爆破技术预处理为苹果渣多酚废物的重新利用提供了新思路，未来将拥有广阔的应用空间。