冬凌草甲素通过调控UBC9表达对肝星状细胞增殖、凋亡的影响

梁会娟任志芳刘 伟张彦忠

(1.新乡医学院第三附属医院临床药学办公室，河南 新乡 453003；2.濮阳医学高等专科学校，河南 濮阳 457000；3.新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453003)

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是一种常见的慢性肝损伤的伤口愈合反应，是慢性肝病最终发展为肝硬化或肝细胞癌的重要病理过程。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纤维化的关键细胞，正常肝中HSC处于静止状态，当肝受到异常刺激时，HSC活化、增殖并分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，导致肝ECM合成和降解失衡，促进HF形成[1]。因此，如何有效的抑制HSC增殖，诱导其凋亡是防治HF的重要措施。冬凌草甲素是从冬凌草中分离得到的二萜类化合物，具有抗炎、抗癌、神经保护等多种生物学功能[2－3]。有文献报道冬凌草甲素可诱导HSC凋亡和周期阻滞，抑制内源性和转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)诱导的ECM合成，是一种潜在的预防HF药物[4]。然而，冬凌草甲素抗HF的潜在分子机制并未完全阐明。泛素结合酶9(ubiquitin Conjugating Enzyme 9，UBC9)是小泛素样分子相关修饰物(small ubiquitin-like molecular related modifiers，SUMO)泛素化过程的唯一接合酶，研究显示UBC9参与HSC凋亡过程，下调UBC9可抑制HF进程[5]。但冬凌草甲素能否调控UBC9影响HF进程尚未可知。本研究以UBC9为切入点，探讨冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖、凋亡的影响和分子机制，以期为冬凌草甲素用于临床防治HF提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 细胞

大鼠肝星状细胞HSC-T6购于美国模式生物保藏中心。

1.2 主要试剂与仪器

杜尔伯格伊戈尔培养基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清购于美国Gibco公司；冬凌草甲素(批号111721-201704，纯度≥99.7%)购于中国食品药品检定研究院；UBC9小干扰RNA(UBC9 small interfering RNA，si-UBC9)及其阴性对照(small interfering RNA nagative control，si-NC)、UBC9过表达载体(UBC9 overexpression vector， pcDNA-UBC9)、空载体(Empty vector plasmid，pcDNA)由上海吉玛制药公司提供；凋亡试剂盒、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒购于上海碧云天公司；山羊抗兔二抗、兔源UBC9抗体、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl相关X蛋白(Bcl associated x protein，Bax)抗体购于上海赛信通生物技术公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于大连TaKaRa生化科技公司；TRIzol试剂、LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养和实验分组

复苏HSC-T6细胞后，用含1%青链霉素双抗、10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、CO2体积分数5%、湿度为70%~80%的培养箱中培养。每隔1 d换液1次，当细胞密度到80%时，即可进行传代培养。分别采用冬凌草甲素浓度为10、20、40μmol/L的细胞培养液培养HSC-T6细胞48 h，依次记为冬凌草甲素-低组、冬凌草甲素-中组、冬凌草甲素-高组[6]。同时设置对照组即正常培养的HSCT6细胞。按照下述方法检测HSC-T6细胞增殖、凋亡、增殖凋亡相关蛋白、UBC9的表达水平。

为证实冬凌草甲素对肝星状细胞增殖、凋亡的影响与调控UBC9表达有关，将HSC-T6细胞分为si-NC组(转染si-NC)、si-UBC9组(转染si-UBC9)、冬凌草甲素＋pcDNA组(转染pcDNA后用含40 μmol/L冬凌草甲素的细胞培养液孵育48 h)、冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9组(转染pcDNA-UBC9后用含40μmol/L冬凌草甲素的细胞培养液孵育48 h)。细胞转染参照LipofectamineTM2000说明书进行。

1.3.2 MTT实验检测细胞增殖

取5×103个对数期HSC-T6细胞接种96孔板，当细胞贴壁后，按照上述实验分组进行干预处理后，加入20μL MTT试剂，反应4 h，吸取孔内培养液，再加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，当结晶溶解后用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度(absorbance，A)值。细胞增殖抑制率＝[(A对照孔－A实验孔)/(A对照孔－A空白孔)]×100%

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

用适量结合缓冲液重悬各组HSC-76细胞，向500μL细胞悬液中添加5μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI溶液，混合均匀后，室温避光条件下反应15 min，上机检测细胞凋亡率。

1.3.4 蛋白质印记(Western blot)检测蛋白表达水平

使用RIPA裂解液对各组HSC-T6细胞进行裂解。制备十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶。将蛋白样品与适量上样缓冲液混匀，沸水浴加热3 min变性蛋白。取30μg蛋白样品上样后100 V电泳90 min分离蛋白样品，湿法转膜至硝酸纤维素膜后，置于5%脱脂牛奶中4℃封闭过夜。置于稀释的一抗溶液中室温反应2 h；置于二抗稀释液中孵育1 h。显影后用凝胶成像系统分析目的蛋白(内参为GAPDH)的相对表达水平。

1.3.5 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测UBC9 mRNA表达水平

TRIzol试剂提取各组HSC-76细胞总RNA，以逆转合成的cDNA为模板进行qPCR扩增。95℃预变性10 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环。2－ΔΔCt法分析UBC9 mRNA相对表达水平。引物序列(5’-3’):UBC9上游GGAAGTCCCGAGACAAAGGG，下游CAGCCACGAA ACCAAATGGG，GAPDH上游TGGACCAAGTACAT GAACCACC，下游CTGGTGATTGGACACGGTGA。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0进行统计学分析。实验独立重复3次，计量资料符合正态分布以平均数±标准差(±s)表示。两组间统计分析采用独立样本t检验，多组间统计分析采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响

与对照组比较，冬凌草甲素-低、-中、-高剂量组HSC-T6细胞CyclinD1蛋白表达显著降低，细胞抑制率、p21蛋白表达显著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素对HSC-T6细胞增殖和相关蛋白表达的影响具有剂量依赖性。见表1和图1。

表1 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表1 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与对照组相比，*P<0.05；与冬凌草甲素-低组相比，＃P<0.05；与冬凌草甲素-中组相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分组Groups抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1 CyclinD1 p对照组Control group 0.00±0.03 0.64±0.冬凌草甲素-低组Oridonin-low group 11.25±1.17* 0.52±0.冬凌草甲素-中组Oridonin-medium group 28.36±2.74*＃ 0.39±0.冬凌草甲素-高组Oridonin-high group 49.68±4.33*＃＆ 0.24±0.203.542 41.244 F蛋白rotein p21蛋白p21 protein 06 0.20±0.02 05* 0.33±0.03*04*＃ 0.46±0.04*＃03*＃＆0.59±0.05*＃＆ 62.593 P 0.000 0.000 0.000?

图1 增殖相关蛋白表达Figure 1 Expression of proliferation-related proteins

2.2 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响

与对照组比较，冬凌草甲素-低、-中、-高剂量组HSC-T6细胞Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax蛋白表达、凋亡率显著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素对HSC－T6细胞凋亡和相关蛋白表达的影响具有剂量依赖性。见表2和图2。

图2 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响Figure 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与对照组相比，*P<0.05；与冬凌草甲素-低组组相比，＃P<0.05；与冬凌草甲素-中组组相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分组Groups凋亡率(%)Apoptosis rate Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein对照组Control group 7.32±0.71 0.77±0.07 0.29±0.03冬凌草甲素-低组Oridonin-low group 11.65±1.23* 0.64±0.06* 0.44±0.04*冬凌草甲素-中组Oridonin-medium group 17.32±1.65*＃ 0.52±0.04*＃ 0.56±0.05*＃冬凌草甲素-高组Oridonin-high group 22.14±2.19*＃＆ 0.36±0.03*＃＆ 0.68±0.06*＃＆52.834 33.264 38.826 P 0.000 0.000 0.000 F

2.3 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6中UBC9表达的影响

与对照组比较，冬凌草甲素-低、-中、-高剂量组HSC-T6细胞UBC9 mRNA和UBC9蛋白表达显著降低(P<0.05)，冬凌草甲素对UBC9 mRNA和UBC9蛋白表达的影响具有依赖性。见表3和图3。

图3 UBC9蛋白表达Figure 3 Expression of UBC9 protein

表3 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6中UBC9表达的影响(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

表3 冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6中UBC9表达的影响(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与对照组相比，*P<0.05；与冬凌草甲素-低组组相比，＃P<0.05；与冬凌草甲素-中组组相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分组Groups UBC9 mRNA UBC9蛋白UBC9 protein对照组Control group 1.00±0.05 0.84±0.08冬凌草甲素-低组Oridonin-low group 0.75±0.07* 0.71±0.06*冬凌草甲素-中组Oridonin-medium group 0.63±0.06*＃ 0.56±0.04*＃冬凌草甲素-高组Oridonin-high group 0.49±0.04*＃＆ 0.41±0.03*＃＆F 44.532 33.216 P 0.000 0.000

2.4 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响

与si-NC组比较，si-UBC9组HSC-T6细胞UBC9蛋白表达显著降低，表明HSC-T6细胞中UBC9表达受到抑制。抑制UBC9表达后，HSC-T6细胞CyclinD1蛋白表达显著降低，增殖抑制率、p21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表4和图4。

表4 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表4 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与si-NC组相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

分组Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein阴性对照si-NC 0.83±0.07 6.33±0.61 0.62±0.06 0.22±0.02干扰UBC9表达组si-UBC9 0.39±0.04* 41.58±4.22* 0.28±0.03* 0.55±0.05*t 9.453 14.319 8.779 10.614 P 0.001 0.000 0.001 0.000

图4 UBC9和增殖相关蛋白表达Figure 4 Expression of UBC9 protein

2.5 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响

抑制UBC9表达后，HSC-T6细胞Bcl-2蛋白表达降低，凋亡率、Bax蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表5和图5。

表5 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表5 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与si-NC组相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

图5 干扰UBC9表达对大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡的影响Figure 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

2.6 过表达UBC9逆转冬凌草甲素(40μmol/L)对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖和凋亡的作用

与对照组比较，冬凌草甲素组HSC-T6细胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表达显著降低，p21和Bax蛋白表达、增殖抑制率、凋亡率显著升高；与冬凌草甲素＋pcDNA组比较，冬凌草甲素＋pcDNAUBC9组HSC-T6细胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表达显著升高，p21和Bax蛋白表达、增殖抑制率、凋亡率显著降低(P<0.05)。见表6和图6。

表6 UBC9过表达逆转了冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表6 UBC9过表达逆转了冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:与对照组相比，*P<0.05；与冬凌草甲素＋pcDNA组相比，＃P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin＋pcDNA group，＃P<0.05.

分组Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio凋亡率(%)Apoptosis rate CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein对照组Control group 0.82±0.07 0.00±0.02 6.32±0.63 0.63±0.06 0.21±0.02 0.78±0.07 0.27±0.03冬凌草甲素Oridonin 0.41±0.04* 47.21±4.33* 21.62±2.13* 0.23±0.03* 0.57±0.05* 0.35±0.03* 0.67±0.06*冬凌草甲素＋pcDNA Oridonin＋pcDNA 0.38±0.03 48.65±4.72 23.58±2.36 0.22±0.02 0.58±0.06 0.34±0.03 0.69±0.07冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9 Oridonin＋pcDNA-UBC9 0.71±0.07＃ 20.11±2.03＃ 11.28±1.14＃ 0.52±0.05＃ 0.33±0.03＃ 0.67±0.06＃ 0.39±0.04＃F 46.634 145.099 69.359 69.514 54.203 58.447 47.236 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图6 UBC9过表达逆转了冬凌草甲素对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖和凋亡的作用Figure 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

3 讨论

冬凌草甲素是东亚地区常用中草药冬凌草的天然活性成分，近年来因其广泛的生物活性和治疗多种疾病的潜力而受到越来越多的关注。研究显示，冬凌草甲素通过调节相关信号通路抑制细胞增殖、触发自噬、诱导凋亡、阻滞细胞周期进展等机制对肝癌[7]、胆管癌[8]、神经母细胞瘤[9]等多种类型恶性肿瘤表现出抗肿瘤作用，是潜在的癌症候选治疗药物。冬凌草甲素还可抑制博莱霉素诱导的小鼠肺组织中平滑肌肌动蛋白和I型胶原蛋白表达，减轻肺泡空间塌陷、肺气肿和炎症细胞浸润，防治肺纤维化病变[10]。此外，冬凌草甲素还可通过促进P21相关的自噬来预防心肌肥大[11]。本研究探讨冬凌草甲素的抗HF作用发现，冬凌草甲素可显著抑制HSC-T6细胞增殖，诱导细胞凋亡，并呈显著的量效依赖关系，与Bohanon等[4]研究结果相吻合。CyclinD1和P21细胞增殖过程中的关键调控蛋白，P21通过抑制周期素依赖激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)/CyclinD1复合物活性，抑制G1-S期相变发挥抗增殖作用[12]。Bcl-2和Bax是细胞凋亡调控中重要的蛋白，Bax表达增加、Bcl-2表达降低可促进线粒体膜通透性改变，抑制孔道开放以及抑制细胞色素C从线粒体释放，抑制Caspases活化进而抑制细胞凋亡发生[13]。本研究显示，冬凌草甲素呈剂量依赖性抑制CyclinD1、Bcl-2表达，促进P21、Bax表达，这提示冬凌草甲素可能通过调控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白抑制HSC-T6增殖并诱导其凋亡。

UBC9是UBC家族的重要成员，其通过促使活化的SUMO与目标蛋白接合，进而介导SUMO发挥蛋白调节作用，是纤维化的关键调节因子[14]。研究显示，在肾脏纤维化过程中UBC9表达上调[15]。沉默UBC9通过抑制早幼粒细胞白血病蛋白类泛素化可降低主动脉缩窄小鼠心肌纤维化的发展，并部分改善其心功能[16]。在活化的人HSC细胞LX-2中UBC9表达显著上调，沉默UBC9可明显抑制HSC增殖，降低平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原的表达水平，进而阻止HF[17]。此外，多种肝癌细胞中UBC9亦呈高表达，干扰UBC9表达可明显降低肝癌细胞的增殖、迁移能力，提高其凋亡水平[18－19]。为探讨UBC9在冬凌草甲素抗HF中的作用，本研究检测冬凌草甲素干预后HSC-T6细胞中UBC9表达水平，结果显示冬凌草甲素呈剂量依赖性抑制UBC9表达水平，提示UBC9表达下调可能与冬凌草甲素的抗HF作用有关。进一步研究显示，转染si-UBC9干扰UBC9表达对HSC-T6细胞亦具有显著的增殖抑制和凋亡作用。此外，本研究显示过表达还能够逆转冬凌草甲素对HSC-T6细胞的增殖、凋亡以及其相关蛋白表达的影响，提示冬凌草甲素对HSC-T6细胞的增殖抑制和凋亡促进作用抑制UBC9表达有关。

综上所述，冬凌草甲素可抑制HSC-T6细胞增殖，促进细胞凋亡，进而具有预防HF的潜在价值，其机制与抑制UBC9表达有关，这为开发冬凌草甲素用于临床防治HF奠定了理论基础。