基于NF-κB/IκBα信号通路探讨“通经利浊”针法对急性痛风性关节炎大鼠保护作用的机制研究

齐 伟李 丽张 岳穆双双胡 德王淑敏*王朝辉*

(1.长春中医药大学针推学院，长春 130117；2.深圳市宝安纯中医治疗医院骨伤科，深圳 518101；3.长春中医药大学药学院，长春 130117)

痛风是炎症性关节炎的一种形式，是由于单钠尿酸盐(monosodium urate，MSU)晶体在人体组织和体液中的沉积所致。由于饮食和生活习惯的改变，在工业化国家中至少有4%的成年人受到痛风的困扰[1－2]。痛风的治疗通常需要联合使用抗炎药物和降尿酸药物，如非甾体抗炎药/环氧化酶抑制剂、秋水仙碱、糖皮质激素、丙磺舒和别嘌醇[3]。尽管短期药物治疗对痛风有益，但痛风极易反复发作，同时长期药物治疗则会产生副作用[4]。综上，临床上迫切需要疗效更好、安全性更高的抗痛风药物及疗法。

近期的研究多集中在寻找治疗痛风性关节炎而无明显不良反应的替代疗法上。针灸是替代医学的一种形式，因为它的不良反应发生率非常低，几乎无副作用，并且在治疗疼痛相关疾病中疗效确切[5－6]，因此针灸在患者中很受欢迎。同时，探索针灸发挥疗效的生化机制越来越受到重视。研究认为针刺刺激可以激活位于特定穴位深处的神经纤维和受体。皮肤和深部组织损伤可能伴随着局部炎症反应[7]。

针灸参与调节炎症性疼痛已有文献报道[8－10]。在弗氏佐剂诱导的炎症模型中，电针可减轻炎症剂引起的疼痛反应和脊髓中谷氨酸受体的表达[9]。在角叉菜胶诱发的炎症模型中，针刺联合亚有效剂量的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂可延长抗痛觉反应的时间，且无明显副作用[10]。另有研究表明，电针可抑制大鼠的脊髓背角星形胶质细胞活性，并减少了炎性细胞因子IL-6、IL-1和TNF-α的释放[11]。此外，针刺可明显抑制关节炎模型中IL-1β的上调[12]。鞘内注射IL-1受体拮抗剂可显著缓解癌症引起的痛觉反应，这表明针刺是通过抑制IL-1β的表达来缓解骨癌引起的疼痛[13]。

临床观察发现针刺对急性痛风性关节炎显示出良好的治疗效果[14]，针刺对MSU诱导的大鼠急性痛风性关节炎同样有效[15]。针刺“通经利浊”针法是治疗急性痛风性关节炎的有效临床方法[16]。通经利浊针法取足阳明之足三里与足太阴之阴陵泉，均属合穴，此两穴相配有健脾、化湿通络之功。再选取三阴交以活血化瘀、宣壅通络、利尿通淋，促进湿浊邪气从小便排出。此三穴共用，共奏清热利湿，宣壅通络之效。

但是，“通经利浊”针法针刺对急性痛风性关节炎的保护作用机制尚不清楚。本研究的目的是探讨“通经利浊”针法针刺治疗保护MSU诱导的大鼠急性痛风性关节炎的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

从辽宁长生生物技术有限公司[SCXK(辽)2020-0001]购买了无特定病原级(specefic pathogen free，SPF)雄性SD大鼠40只，6周龄，体重(220±20)g。大鼠自由获取食物和水，常规饲养1周。本研究经过长春中医药大学伦理委员会批准(IACUC-20190169)，在长春中医药大学动物中心喂养[SYXK(吉)2018-0014]，严格按照中国实验动物管理法规处理动物，遵守3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

秋水仙碱片(C22H25NO6，分子量:399.44)购自昆明制药；单钠尿酸盐(C5H3N4O3Na，分子量:190.09)购自Sigma；IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒均购自南京建成；抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα等所有抗体均购自Cell Signaling Technology；小型动物麻醉机(VMR型)购自MATRX(美国)；电针仪(SDZ-V型)购自华佗。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型建立及分组

将动物分为4组(每组n＝10):(1)空白组；(2)模型组；(3)“通经利浊”针法组；(4)秋水仙碱组。秋水仙碱组大鼠口服秋水仙碱(1 mg/kg)7 d，而空白组和模型组则给予相同量的生理盐水灌胃。针刺治疗根据参考文献[17]中的定位方法选择“后三里”、“阴陵泉”、“三阴交”。使用小型动物麻醉机麻醉后，针刺“后三里”，直刺5 mm；“阴陵泉”，直刺5 mm；“三阴交”，直刺3 mm。针刺后用电针仪，以一侧的后三里-三阴交为连续电针连接对穴，取连续波(2 Hz，0.6 mA，0.45 ms)行电针刺激，以大鼠的大腿轻轻抖动，不影响麻醉效果为度。每日针刺1次，每次10 min，7次为1疗程，共干预1疗程。针刺组和秋水仙碱组在急性痛风性关节炎模型建立前7 d接受治疗。

1.3.2 急性痛风性关节炎模型

参照Shiels等[18]研究方法制备得到了MSU晶体，洗涤并风干。将250 mg MSU晶体溶于10 mL溶液(生理盐水:聚山梨酯-80＝9∶1)中制得浓度为25 mg/mL的MSU溶液。第7天将此溶液注入右膝关节腔诱发急性痛风性关节炎模型后，即从双眼眶后神经丛收集血液样品1 mL，2500 r/min下离心15 min，将血清储存在－20℃下保存直至使用。大鼠关节腔内注射MSU晶体后关节炎迅速出现，关节炎发生率100%[19]。具体表现为大鼠活动明显减少，关节周围局部出现红斑、肿胀伴功能障碍，如行走迟缓、肢体不愿着力负重。显微镜下可见明显的关节炎病理改变，确认造模成功[20]。

1.3.3 促炎症细胞因子检测

酶联免疫吸附试验测定IL-1β、IL-6、TNF-α水平:分离血清1 d后，根据生产商说明书进行操作，检测血清中的促炎症细胞因子水平。

1.3.4 组织病理学检查

处死大鼠后，将膝盖样品在关节线上方和下方分别切开0.5 cm。然后将组织固定在10%中性福尔马林缓冲液中，石蜡浸润，包埋并制成5μm厚切片。用苏木精和伊红(HE)染色法将切片脱蜡并染色。在显微镜下以200倍的放大倍率观察切片。

1.3.5 Western blot分析

将膝盖样品切成小块后在RIPA裂解缓冲液中混合，在冰浴下匀浆。静置30 min，将样品在4℃下12000 r/min离心20 min。收集上清液，使用BCA试剂盒，以牛血清白蛋白作为标准品测定蛋白质浓度。将上清液加载到12%蛋白凝胶上，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(120 V，200 mA，60 W，5 h)，蛋白质被转移到PVDF膜上(300 V，200 mA，60 W，2 h)。用5%脱脂奶封闭2 h。将膜与单独的一抗、抗-p-NF-κBp65、抗-NF-κBp65、抗-p-IαBα、抗-IκBα和抗GAPDH共同在4℃下孵育过夜，用TBST缓冲液洗涤后，将膜与二抗在室温下孵育2 h。使用ECL化学发光检测试剂盒对免疫反应性条带成像，使用Image Lab 4.1(Bio-Rad)进行信号收集和光密度图像分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，结果以平均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 “通经利浊”针法针刺对促炎症细胞因子的影响

与空白组相比，模型组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01)。通过“通经利浊”针法针刺治疗可以显著逆转由MSU晶体引起的促炎症细胞因子升高。秋水仙碱组与针法组的疗效类似(图1)。

图1 “通经利浊”针法对促炎症细胞因子的影响Figure 1 Effects of SMCTD acupuncture on serum proinflammatory cytokines.

2.2 “通经利浊”针法针刺对膝关节组织学变化的影响

在空白组动物的右膝关节病理切片中可观察到正常的关节结构和骨关节(图2A)。MSU晶体诱发的急性痛风性关节炎大鼠(模型组)表现出轻度滑膜水肿，关节间隙变小，关节侵蚀明显(图2B)。与之相反，秋水仙碱组(图2C)和“通经利浊”针法组(图2 D)抑制MSU晶体诱发的急性痛风性关节炎大鼠的关节侵蚀，关节间隙增加。

图2 “通经利浊”针法对踝关节组织病理学检查的影响Figure 2 Effects of SMCTD acupuncture on myocardial histopathological examination

2.3 “通经利浊”针法针刺对NF-κB信号通路的影响

本研究检测“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱预治疗是否会影响NF-κB通路的活化。结果表明，通过MSU晶体处理可增加NF-κBp65含量，而通过“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱预处理可有效降低其含量(P<0.01，P<0.01)(图3A)。此外，MSU晶体激发导致了IκBα磷酸化和随后的降解(图3B)。然而，通过“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱预处理，MSU晶体诱导的IκBα磷酸化降低(P<0.01)(图3C)。上述结果均表明，“通经利浊”针法针刺的治疗通过抑制NF-κB/IκBα信号通路的活化而发挥作用。

图3 “通经利浊”针法对NF-кB信号通路的影响Figure 3 Effects of SMCTD acupuncture on NF-кB pathway

3 讨论

尿酸单钠晶体诱导的急性痛风性关节炎模型是由晶体沉积或急性结晶引起的。多项研究表明，MSU模型引起的症状与临床观察到的症状类似[21]，如水肿、红斑以及跛行。MSU引起短暂的炎症反应，其特征为在关节中的晶体沉积，同时伴有大量多形核中性粒细胞吞噬、炎症性水肿和严重疼痛[22]。从本研究的组织病理学检查结果来看，MSU可导致膝关节肿胀、跛行和伤害行为。“通经利浊”针法或秋水仙碱的预治疗可显著缓解MSU引起的机械性异常性疼痛，并减少嗜中性粒细胞向关节间隙的强烈浸润。

炎症是诱发急性痛风性关节炎的关键因素。在实验研究中，炎症过程是由MSU晶体在周围组织中沉积引起的。MSU晶体与骨髓中的T淋巴细胞相互作用，活化炎症小体，从而促进IL-6和IL-18产生[23]。活化的炎性细胞因子促进炎性介质的表达，这些介质负责T细胞的生长分化，是急性痛风性关节炎的主要病理特征[24]。此外，当前研究表明，活化的炎症小体可触发炎症级联反应并将幼稚T细胞极化为促炎性Th亚群，进而增强炎症反应[25]。本研究中，炎症应激与MSU引起的IL-1β、TNF-α和IL-6显著升高相关。“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱治疗可明显降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的水平，这表明两者的治疗效果可能与抗炎特性有关。

促炎症细胞因子的分泌和成熟受到NF-κB信号传导的严格调节。研究表明疾病发生后组织周围的吞噬细胞会被激活，分泌大量的促炎因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)直接对周围组织造成伤害，在细胞中，NF-κB通过与细胞质中的IκB家族相互作用而失活。具体过程如下:促炎症因子激活NF-κB抑制蛋白(IkB)激酶复合体，使其磷酸化，经蛋白酶小体水解后，与NF-κB发生解离，解除其对NF-κB的抑制作用，进而暴露NF-κB的p50亚基，使其移位细胞核与靶基因启动区或增强子的NF-κB位点结合，启动促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等基因的表达，使得TNF-α、IL-1β和IL-6等合成和分泌增加，进一步加剧损伤；反过来，上述促炎因子又可以加速活化NF-κB在组织间不断扩散及NF-κB核移位，形成恶性循环[26－27]。当用MSU晶体刺激时，IκBα被IκB激酶复合物激活和降解，这使得NF-κB易位进入细胞核并与靶基因结合[28]。活化的NFκB增加了促炎症细胞因子、趋化因子等的基因表达，最终导致了严重的炎症反应[29]。本实验结果表明，“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱能抑制IκBα磷酸化和降解。此外，“通经利浊”针法针刺或秋水仙碱给药，能减弱MSU晶体诱导引起的NF-κBp65核易位。

针灸是治疗与痛风相关疾病(包括痛风性关节炎)的主流替代疗法。其副作用小，很容易被患者接受。“通经利浊”针法是中医治疗痛风性关节炎的一种康复方法[30]。在临床患者和实验动物中，将穴位足三里、阴陵泉和三阴交联合使用可有效治疗痛风性关节炎[31－32]。在本研究中，经“通经利浊”针法针刺治疗后显著减轻了MSU引起的大鼠急性痛风性关节炎，这为“通经利浊”针法治疗痛风性关节炎提供了进一步的实验支持。

综上，本研究表明“通经利浊”针法针刺对MSU晶体诱发的急性痛风性关节炎模型具有良好的疗效，其作用机制可能是通过介导NF-κB/IκBα信号通路抑制促炎症细胞因子。但仍存在不足，与T细胞亚群的关系仍需要进一步研究，相关实验正在进行中。