内脂素通过PI3K/Akt/FoxO1信号通路对糖尿病KKAy小鼠骨骼肌糖脂代谢及胰岛素抵抗的影响

杨 丹姚 衢张 晗张 琳王 茜廖 鑫章 莹李思成高 琳*

(1.遵义医科大学附属医院内分泌科，贵州 遵义 563003；2.川北医学院附属医院健康管理中心，四川 南充 637000)

内脂素(Visfatin)是一种主要表达于内脏脂肪组织和(或)巨噬细胞的脂肪因子[1]，可增加骨骼肌细胞中葡萄糖的转运，促进葡萄糖摄取[2]。研究表明Visfatin在葡萄糖代谢和胰岛素敏感性方面发挥作用，可能参与了2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、肥胖、代谢综合征和多囊卵巢综合征等疾病的发生发展[3－5]。叉头框转录因子1(forkhead box transcription factor 1，FoxO1)在骨骼肌中高表达，当蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)磷酸化后，FoxO1的乙酰化以及泛素化等其他翻译后修饰与磷酸化相互作用，从而影响其转录[6]。丙酮酸脱氢酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4)是FoxO1的下游靶基因，能够调控糖酵解和糖异生途径。研究证实Visfatin可通过调控PI3K/Akt信号途径下游分子糖原合成酶激酶3β和葡萄糖转运体4的活性而促进细胞对葡萄糖的摄取，改善糖脂代谢和IR[7－8]，但Visfatin是否能作用于PI3K/Akt下游FoxO1/PDK4通路而在糖脂代谢及IR中发挥作用，目前鲜有报道。因此，本研究拟探讨Visfatin在PI3K/Akt/FoxO1信号通路中对糖脂代谢及胰岛素敏感性的影响，旨在为防治糖尿病及IR相关疾病提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

10只8周龄SPF级雄性KKAy小鼠，体重为30.0 g左右，20只同周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重为(20.0±2.0)g，连同高脂饲料均购于北京华阜康有限公司[SCXK(京)2019-0008]，普通饲料由重庆腾鑫公司提供，喂养于重庆医科大学实验动物中心[SYXK(渝)2018-0003]，给予充足饲料和自由饮水，环境温度(23±2)℃，湿度40%~60%，控制光照时间8:00~20:00。动物实验经遵义医科大学附属医院动物实验伦理委员会审核批准(KLLY-2018-075)，并严格遵循实验动物使用的3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

Visfatin重组蛋白(以色列PROSPEC公司)；蛋白浓度测定试剂盒、蛋白裂解液及磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司)；脱脂奶粉、兔抗PI3K110α抗体、兔抗Akt抗体、兔抗p-Akt(Ser473)抗体、兔抗FoxO1抗体、兔抗p-FoxO1(Ser256)抗体及兔抗GAPDH抗体(美国CST公司)；兔抗PDK4抗体、兔抗G6Pase抗体及兔抗PEPCK抗体(美国abcam公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏碧云天生物公司)；诺和灵R(丹麦诺和诺德)；DEPC水(生工生物工程(上海)股份有限公司)；TRIzol试剂(TaKaRa公司)；cDNA逆转录试剂盒和2×SYBR Green qPCR master Mix(美国Bimake公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)和胰岛素试剂盒(江苏博深生物科技有限公司)；胶成像系统(德国Analytik Jena公司)；电泳槽及转移槽(美国BIO-RAD公司)；核酸蛋白浓度测定仪(杭州ALLSHENG公司)；雅培血糖仪及配套试纸(英国Abbott公司)；全自动生化仪(日本Olympus公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 造模及分组

C57BL/6J小鼠按照随机数字表分为普通饲料组和高脂饲料组，喂养8周后，C57BL/6J小鼠普通饲料组随机分为普食(ND)组和普食＋内脂素(ND＋V)组，高脂饲料组随机分为高脂(HFD)组和高脂＋内脂素(HFD＋V)组；KKAy小鼠给予高脂饲料喂养8周后，连续2次空腹血糖(FBG)≥13.9 mmol/L定义为糖尿病模型[9]，成模后的KKAy小鼠随机分为糖尿病(DM)组和糖尿病＋内脂素(DM＋V)组；ND＋V组、HFD＋V组和DM＋V组连续3 d腹腔注射重组内脂素蛋白(6μg/kg)[8]，其余各组腹腔注射等量生理盐水，并于注射前后测定相关指标(n＝5)。

1.3.2 葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量实验(ITT)

GTT:将小鼠禁食12 h，测定FBG后腹腔注射2 g/kg的20%葡萄糖溶液，于注射后15、30、60、90、120和180 min尾静脉取血测血糖，并计算GTT曲线下面积(AUCGTT)[10]。GTT实验结束间隔1周后行ITT:将小鼠禁食6 h，然后腹腔注射0.75 U/kg的0.1 U/mL胰岛素溶液后，测定6个时间点(0、15、30、60、90和120 min)血糖水平并计算AUCITT[11]。

1.3.3 标本的采集

小鼠禁食后按50 mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉，取血，室内静置30 min，3000 r/min离心15 min，移液器吸取上清于EP管中，－80℃超低温冰箱保存。打开胸腹腔，用预冷的生理盐水心脏灌注，直至肝变白为止，游离后肢骨骼肌组织，生理盐水洗净，滤纸吸干后存放于冻存管，于液氮中保存。

1.3.4 基础指标的测定

每周定期测定各组小鼠体重和摄食；采用血糖仪测定FBG(禁食6 h)和餐后血糖(PBG)；采用全自动生化仪检测小鼠血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)以及游离脂肪酸(FFA)；采用酶联免疫吸附实验测定小鼠空腹血清胰岛素(FIns)；并计算稳态模型评估胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，公式为(FBG×FIns)/22.5。

1.3.5 RT-qPCR反应

用TRIzol提取骨骼肌组织总RNA，逆转录合成cDNA，SYBR-Green荧光染料RT-qPCR检测骨骼肌组织的 mRNA 表达。PI3K 上游引物 5’-CCCATGGGACAACATTCCAA-3’，下游引物5’-CATGG CGACAAGCTCGGTA-3’；Akt上游引物5’-TCAGGATGTGGATCAGCGAGA-3’，下游引物5’-CTGCAGGCAGCGGATGATAA-3’；FoxO1上游引物5’-AGAGTTAGTGAGCAGGCTACAT-3’，下 游引物5’-CCGCTGTTGCCAAGTCTGA-3’；β-actin上游引物5’-GGTGGGAATGGGTCAGAAGG-3’，下游引物5’-AGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3’。

1.3.6 Western blot检测

各组取适量骨骼肌组织置于冰上的匀浆器中，加入蛋白裂解液和蛋白磷酸酶抑制剂(100∶1)充分研磨，直至乳糜状后转移到EP管中，每隔5 min振荡1次，共30 min，4℃离心10 min，吸取上清测定总蛋白浓度。另取上清与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合后沸水变性5 min，按照每孔40μg蛋白上样进行电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(浓度为1∶1000~1∶2000)4℃孵育摇床过夜，TBST溶液洗膜3次，加入二抗(浓度为1∶10000)室温孵育1 h，洗膜后用ECL曝光显影，VisionWorks软件进行分析条带的灰度值。

1.4 统计学方法

所有数据用平均数±标准差(±s)表示，用SPSS 25.0软件进行分析，用GraphPad Prism 7和Photoshop软件进行作图。多组间比较用单因素方差分析，两组间比较方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s T3检验，P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 造模8周后各组小鼠的体重、摄食和血糖

在喂养8周后，与ND组比较，HFD组和DM组小鼠体重显著增高，DM组小鼠的摄食显著增高；与HFD组比较，DM组小鼠体重和摄食均显著增高(P<0.01)。与ND组和HFD组比较，DM组的FBG和PBG显著增高(P<0.001)。见表1。

表1 喂养8周后三组小鼠的体重、摄食及血糖(±s，n＝5)Table 1 Body weight，food intake and blood glucose in the three groups of mice after 8 weeks of feeded

表1 喂养8周后三组小鼠的体重、摄食及血糖(±s，n＝5)Table 1 Body weight，food intake and blood glucose in the three groups of mice after 8 weeks of feeded

注:与ND组相比，a P<0.01，b P<0.001；与HFD组相比，c P<0.001。Note.Compared with ND group，a P<0.01，b P<0.001.Compared with HFD group，c P<0.001.

指标Index普食组ND group高脂组HFD group糖尿病组DM group体重(g)Body wight 24.90±0.87 30.57±1.11a 41.12±1.58bc摄食(g/d)Food intake 2.51±0.27 2.22±0.17 7.05±0.36bc空腹血糖(mmol/L)FBG 5.76±0.92 7.60±1.03 25.68±6.41bc餐后血糖(mmol/L)PBG 7.60±0.88 9.02±0.73 31.16±4.28bc

2.2 干预后各组小鼠的相关指标

2.2.1 血清生化指标

与ND组比较，HFD组小鼠TC和FFA水平显著增高(P<0.01)，与ND组和HFD组比较，与ND组和HFD组比较，DM小鼠FBG、FIns、TC、TG、FFA和HOMA-IR水平均显著增高(P<0.05)。与DM组相比，DM＋V组的FBG、TC、TG和HOMA-IR显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 六组小鼠血清生化指标(±s，n＝5)Table 2 Serum biochemical parameters of mice in six groups

表2 六组小鼠血清生化指标(±s，n＝5)Table 2 Serum biochemical parameters of mice in six groups

注:与ND组相比，a P<0.05，b P<0.01；与HFD组相比，c P<0.01；与DM组相比，d P<0.05，e P<0.01。Note.Compared with ND group，a P<0.05，b P<0.01.Compared with HFD group，c P<0.01.Compared with DM group，d P<0.05，e P<0.01.

指标Index普食组ND group普食＋内脂素组ND＋V group高脂组HFD group高脂＋内脂素组HFD＋V group糖尿病组DM group糖尿病＋内脂素组DM＋V group空腹血糖(mmol/L)FBG 6.42±0.62 6.47±0.65 9.36±0.16 7.59±1.10 18.70±3.18ac 12.63±7.06d总胆固醇(mmol/L)TC 1.63±0.45 1.41±0.08 3.29±0.51b 3.20±0.36 7.19±0.47bc 4.78±0.63e甘油三酯(mmol/L)TG 0.62±0.29 0.52±0.13 0.40±0.13 0.40±0.25 2.31±0.30bc 1.65±0.31e游离脂肪酸(mmol/L)FFA 0.30±0.01 0.22±0.04 0.46±0.14b 0.36±0.02 0.69±0.08bc 0.61±0.02空腹胰岛(mU/L)FIns 7.68±1.42 7.17±0.24 9.29±0.48 10.60±0.62 15.38±0.74bc 14.71±3.87胰岛素抵抗指数HOMA-IR 2.16±0.18 2.06±0.13 3.87±0.15 3.56±0.36 12.78±2.24bc 7.47±1.95e

2.2.2 葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验

在GTT实验中，注射葡萄糖后15 min时，ND组、ND＋V组、HFD组和HFD＋V组的血糖浓度均上升到最大值，之后开始下降直到180 min时血糖浓度恢复到注射前左右；而DM组小鼠在注射后90 min时血糖才达到峰值，之后开始下降；DM＋V组在t＝30 min时血糖升高到峰值，在t＝180 min血糖回归到0点左右。与ND组比较，HFD组和DM组AUCGTT显著增高(P<0.01或0.001)；与HFD组比较，DM组AUCGTT显著增高(P<0.001)；与DM相比，DM＋V组AUCGTT显著降低(P<0.01)。见图1。

图1 葡萄糖耐量实验和曲线下面积Figure 1 Glucose tolerance test and area under curve

ITT实验中，ND组、ND＋V组、HFD组、HFD＋V组和DM＋V组的血糖均在15~60 min时降至最低点，而DM组血糖先升高后下降，60 min时降至最低。分别与ND组和HFD组比较，DM组AUCITT均显著增高(P<0.001)；和DM组相比，DM＋V组AUCITT显著降低(P<0.01)。见图2。

图2 胰岛素耐量实验和曲线下面积Figure 2 Insulin tolerance test and area under curve

2.2.3 RT-qPCR检测PI3K、Akt及FoxO1的mRNA表达

分别与ND组和HFD组比较，DM组PI3K、Akt的mRNA表达水平均显著降低(P<0.001)，而FoxO1的mRNA表达水平均显著增高(P<0.05)；与ND组相比，ND＋V组FoxO1的mRNA表达显著降低(P<0.05)；与HFD组比较，ND组Akt的mRNA表达组显著增高(P<0.05)；与DM组比较，DM＋V组PI3K及Akt的mRNA表达均显著增高，FoxO1的mRNA表达显著降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组小鼠骨骼肌PI3K、Akt和FoxO1的mRNA表达(±s，n＝5)Table 3 Expressions level of PI3K，Akt and FoxO1 mRNA in skeletal muscle of mice among each group

表3 各组小鼠骨骼肌PI3K、Akt和FoxO1的mRNA表达(±s，n＝5)Table 3 Expressions level of PI3K，Akt and FoxO1 mRNA in skeletal muscle of mice among each group

注:与ND组相比，a P<0.05，b P<0.001；与HFD组相比，c P<0.05，d P<0.01，e P<0.001；与DM组相比，f P<0.01，h P<0.001。Note.Compared with ND group，a P<0.05，b P<0.001.Compared with HFD group，c P<0.05，d P<0.01，e P<0.001.Compared with DM group，f P<0.01，h P<0.001.

基因Genes普食组ND group普食＋内脂素组ND＋V group高脂组HFD group高脂＋内脂素组HFD＋V group糖尿病组DM group糖尿病＋内脂素组DM＋V group PI3K 1.00±0.05 1.09±0.05 0.85±0.09 0.95±0.15 0.48±0.11be 0.81±0.04f Akt 1.00±0.11 1.16±0.14 0.82±0.08a 0.92±0.07c 0.33±0.10be 0.75±0.05h FoxO1 0.53±0.14 0.32±0.16a 0.43±0.12 0.41±0.14 0.72±0.16ad 0.26±0.10h

2.2.4 Western blot法检测PI3K/Akt信号通路及其下游相关分子的蛋白表达

与ND组比较，DM组PI3K110α、p-Akt蛋白表达水平显著降低，FoxO1、p-FoxO1和PDK4的蛋白表达水平均显著增高(P<0.05)；与ND组比较，HFD组FoxO1的蛋白表达显著降低，而p-FoxO1的蛋白表达显著增高(P<0.05)；ND＋V组FoxO1蛋白表达水平较ND组显著降低(P<0.001)。与HFD组相比，DM组的p-Akt、p-FoxO1的蛋白表达水平均显著降低，FoxO1、PDK4和PEPCK的蛋白表达水平均显著增高(P<0.05)。与DM组比较，DM＋V组中PI3K110α、p-Akt及p-FoxO1的蛋白表达均显著增高，而FoxO1、PDK4和PEPCK的蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图3~6。

图3 各组小鼠骨骼肌组织PI3K和Akt的活性蛋白表达Figure 3 Active pntein expression of PI3K and Akt in skeletal muscle tissues of mice in each group

图4 各组小鼠骨骼肌组织FoxO1的蛋白表达Figure 4 Protein expression of FoxO1 in skeletal muscle tissues of mice in each group

图5 各组小鼠骨骼肌组织PDK4的蛋白表达Figure 5 Protein expression of PDK4 in skeletal muscle tissues of mice in each group

图6 各组小鼠骨骼肌组织G6Pase和PEPCK的蛋白表达Figure 6 Protein expression of G6Pase and PEPCK in skeletal muscle tissues of mice in each group

3 讨论

T2DM是一种多基因遗传的慢性代谢紊乱综合征，主要以糖脂代谢紊乱和胰岛素作用受损、同时靶细胞或靶器官对胰岛素刺激的反应能力减弱为特征[12－13]。近年来研究发现Visfatin可作用于胰岛素受体，使胰岛素受体底物酪氨酸磷酸化以激活下游PI3K/Akt等信号通路，具有与胰岛素类似的功能[14]。前期研究也发现Visfatin可以通过PI3K/Akt信号途径上调其下游糖原合成酶激酶3β和葡萄糖转运体4的活性，下调FoxO1的表达，增加L6骨骼肌细胞和KKAy小鼠骨骼肌组织对葡萄糖的摄取，改善IR[7－8，15]，并且FoxO1与FBG、TG和HOMA-IR呈正性相关[16]。

骨骼肌是调节糖脂代谢的关键外周组织，Visfatin还可影响骨骼肌的胰岛素敏感性，维持葡萄糖稳态[4]。临床研究表明Visfatin血浆浓度与人体内脏脂肪量密切相关，在肥胖和T2DM人群中Visfatin浓度明显升高，提示其可能参与肥胖相关的IR和糖尿病的发生[17]。FoxO1是能量稳态的关键转录因子，能直接上调骨骼肌组织PDK4的表达，减少葡萄糖的利用[18－19]，本实验中KKAy糖尿病小鼠的体重、摄食和血糖显著增高，出现典型的糖代谢紊乱特征[20]，分别与ND组和HFD组比较，DM组FBG、TC、TG、FFA、FIns、AUCGTT、AUCITT及HOMA-IR水平均显著增高，HFD组小鼠TC和FFA水平较ND组均显著增高，而注射Visfatin重组蛋白后，DM＋V组的FBG、TC、TG、HOMA-IR、AUCGTT和AUCITT水平显著降低，提示Visfatin可改善糖尿病小鼠的胰岛素敏感性及糖脂代谢。糖尿病小鼠骨骼肌PI3K、Akt的基因及蛋白活性表达较ND和HFD组显著降低，而FoxO1及PDK4的基因和蛋白表达水平较ND组和HFD组均明显增高；注射内脂素后DM组骨骼肌PI3K、Akt的基因和蛋白活性表达均显著增高，而FoxO1及PDK4基因和蛋白表达水平均显著降低。本实验证实Visfatin下调了骨骼肌FoxO1和PDK4的表达，但HFD组及DM＋V组FoxO1与p-FoxO1蛋白水平表达结果不一致，我们推测:(1)FoxO1不仅由磷酸化修饰，可能还与泛素化及乙酰化等其他蛋白翻译后修饰作用有关，从而影响FoxO1的表达；(2)FoxO1包含三个由Akt控制的磷酸化位点，即Thr24、Ser256和Ser319，而本实验中只检测了FoxO1蛋白磷酸化位点其中之一，不能完全代表p-FoxO1蛋白水平的表达。

FoxO1可诱导其下游靶点PDK4的转录激活，同时，PDK4可使丙酮酸脱氢酶复合物磷酸化失活，减少丙酮酸进入三羧酸循环，从而调节糖异生和糖酵解途径，而葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)是催化糖异生的关键酶[19，21]。研究发现通过诱导PDK基因，过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活因子1α将促进丙酮酸代谢为乙酰辅酶A，进入糖异生途径；相反，抑制PDK4基因后，可降低血糖、改善IR[22]。在肥胖小鼠和IR的肝细胞中PEPCK和G6Pase表达明显增加，而抑制PEPCK和G6Pase的表达可通过减少肝糖异生从而逆转IR[23－24]。本实验中DM＋V组小鼠骨骼肌中PEPCK蛋白表达明显低于DM组小鼠，与上述研究结果一致，但G6Pase蛋白表达无明显差异，可能是实验中注射Visfatin的时间较短所致。因此，进一步构建Visfatin过表达腺相关病毒载体，拟研究长时间持续作用的Visfatin对糖脂代谢相关分子基因和蛋白表达的影响，有待于更进一步证实Visfatin在糖尿病及IR中的作用。

总之，在KKAy糖尿病小鼠骨骼肌组织中，Visfatin可能通过PI3K/Akt途径下调FoxO1、PDK4的表达，发挥改善糖脂代谢和IR的作用。本研究也存在一定的局限性，后续将继续完成过表达腺相关病毒实验，同时用腺相关病毒干扰PI3K/Akt/FoxO1信号通路后观察FoxO1及其下游分子的表达变化，以期为糖尿病和IR防治提供潜在的视点。