多靶点抑制剂西奥罗尼增强人胶质瘤细胞放射敏感性的机制*

何 超， 周玉玲， 王 荣， 魏 威， 刘志刚

（中山大学附属第五医院肿瘤中心，广东省生物医学影像重点实验室，广东珠海 519000）

多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是侵袭性较强的原发性恶性肿瘤，其中位生存期不到15 个月，5 年生存率不到4%［1］。GBM 患者的“标准治疗”是先通过手术最大程度切除肿瘤，然后进行同步放化疗后辅助替莫唑胺化疗［2-3］。放射治疗作为恶性胶质瘤重要的治疗方式，能有效的直接杀伤肿瘤细胞［4］。放射治疗有剂量限制，增加总放射剂量会增加放射损伤副作用［5］。此外，GBM 单纯放疗的治疗效果欠佳［6］。因此，需要寻找放疗增敏剂以期提高放疗的治疗效果［1］。

西奥罗尼（chiauranib）是一种多靶点选择性激酶抑制剂，已报道的靶点是血管生成相关激酶，包括血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）1、2、3和c-Kit，慢性炎症相关激酶集落刺激因子1受体（colony-stimulating factor-1 receptor，CSF-1R）和有丝分裂相关激酶Aurora B［8-10］。研究表明，西奥罗尼可以通过抑制VEGFR2 和Aurora B 来减少肝细胞癌和胃癌细胞的增殖［11］。此外，西奥罗尼还可以通过抑制急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）和非霍奇金淋巴瘤的血管生成和有丝分裂来抑制肿瘤的增殖［8-9］。由于西奥罗尼的抑制血管生成等作用可以抑制肿瘤生长，因此西奥罗尼与其他治疗方式（如放疗）联合使用有可能会获得更好的抗肿瘤作用。本研究通过西奥罗尼联合X 射线处理人胶质瘤细胞，探索西奥罗尼对人胶质瘤细胞的放射增敏作用及其作用机制。

材 料 和 方 法

1 细胞、主要试剂和仪器

人胶质瘤U251 细胞和T98G 细胞购于上海吉凯基因公司。

兔抗人CSF-1R 和p-CSF-1R 抗体购于Abcam；兔抗 人Cdc2、p-Cdc2、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、cleaved PARP、γH2AX、AKT、p-AKT、CHK2 和p-CHK2 抗体，以及HRP 标记的山羊抗兔IgG 购于Cell Signaling Technology；高糖DMEM 培养基、青霉素/链霉素、胰蛋白酶和胎牛血清购于Gibco；CCK-8试剂盒购于MedChemExpress；细胞周期试剂盒和凋亡试剂盒购于BD。

酶标仪（Molecular Devices）；水平凝胶电泳系统（Bio-Rad）；荧光显微镜（Nikon）；流式细胞仪（Beckman）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将U251 细胞和T98G 细胞培养在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM 培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。

2.2 辐照条件和剂量 使用Infinity linear accelerator（Elekta）对U251 细胞和T98G 细胞进行不同剂量（0、2、4 和6 Gy）的辐照，剂量率为500 MU/min，靶源距为100 cm。

2.3 细胞活力的检测 将U251 细胞和T98G 细胞以每孔3×103个的细胞密度均匀接种于96孔板中，并用不同浓度的西奥罗尼（0、2.5、5、10、20 和40 μmol/L）处理细胞，然后置于培养箱中培养48 h。待0 μmol/L 组细胞融合度达80%左右，进行检测。检测前弃旧培养基，用新鲜培养基以1∶10稀释CCK-8，并将100 μL 稀释液添加到每个孔中。在37 ℃下孵育2 h，用酶标仪在波长450 nm 处测量吸光度（A）值。得到对应吸光度值后用GraphPad Prism 8.0 软件计算出该药物的半数抑制浓度（IC50）。

2.4 平板集落形成实验 6孔板中分别均匀接种一定数量的U251 细胞和T98G 细胞，并且每孔分别用西奥罗尼、X 射线和二者联合处理。空白组、2 Gy 处理组、4 Gy 处理组和6 Gy 处理组的接种细胞数分别为400、400、600 和800 个。接种24 h 后，弃旧培养基换成含有西奥罗尼的新鲜培养基。接种48 h 后，将细胞用X 射线（2、4 和6 Gy）处理。然后将细胞置于培养箱中培养9 d。显微镜下观察集落细胞数达50个以上后，弃旧培养基，用4%多聚甲醛（Bioss）固定15 min，然后用0.05%结晶紫（Sigma Life Science）染色过夜。然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。再用肉眼对细胞集落进行计数。后用使用Graph-Pad Prism 8.0软件，将4个独立实验的数据表示为均数±标准误（mean±SEM），并根据线性-二次模型（linear-quadratic model，L-Q）进行分析并绘制存活曲线。

2.5 细胞周期和细胞凋亡分析 将U251 细胞和T98G 细胞接种到6 cm 培养皿中，按照上述分组在第2 天和第3 天分别用西奥罗尼（2.5 μmol/L）和X 射线（4Gy）处理。在第4 天，用预冷的70%乙醇固定样品过夜，并在测试前用碘化丙啶（PI）室温避光染色15 min，然后用流式细胞术进行细胞周期检测。将U251 细胞接种到6 cm 培养皿中，按照上述分组在第2 天和第3 天分别用西奥罗尼（2.5 μmol/L）和X 射线（4 Gy）处理。在第5 天，用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶（1×）消化细胞后，用annexin V-FITC 染色15 min，然后用流式细胞术进行细胞凋亡检测。流式细胞仪用于细胞周期和凋亡检测，ModFit LT 3.0（Verify Software House）和FlowJo 10.0（BD Biosciences）用于分析细胞周期和凋亡数据。

2.6 Western blot 检测蛋白水平 用于Western blot实验的U251 细胞的处理方式与用于细胞周期检测的细胞相同。在第5 天，每个皿加入100 μL 冰冷的裂解缓冲液以裂解细胞。进行BCA 蛋白定量测定，并用5× loading buffer 稀释样品。然后在SDS-PAGE凝胶上样，并通过湿转系统将蛋白条带转移至PVDF膜。用10%脱脂牛奶阻断非特异性蛋白质结合。将PVDF 膜置于含相应Ⅰ抗的溶液中于4 ℃孵育过夜（稀释度1∶1 000）。在第2 天，将PVDF 膜置于含对应Ⅱ抗的溶液中室温下孵育1 h，然后进行化学发光检测蛋白信号。

2.7 免疫荧光实验 将洁净无菌的细胞爬片置于24 孔板底，然后将U251 细胞和T98G 细胞以每孔5×103个的细胞密度接种到24孔板中，同时在每孔加入干净的细胞爬片。设对照组和西奥罗尼（2.5 μmol/L）组，然后进行辐照处理（4 Gy）处理。在第4 天，用4%多聚甲醛将细胞室温固定30 min，用PBS 洗5min×3遍。使用0.5%Triton-100进行细胞室温透膜20min，再用PBS洗5 min×3遍。用5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室温封闭1 h，然后将爬片置于含γH2AX抗体（CST，稀释度为1∶500）的溶液在4 ℃孵育过夜。次日，用PBS清洗爬片5 min×3遍，后将爬片置于荧光团偶联的Ⅱ抗（CST，稀释度为1∶400）在室温下避光孵育1 h。再用PBS 清洗爬片5 min×3遍。最后，用DAPI对细胞核进行染色，并将爬片固定在载玻片上，并置于黑暗环境中。然后使用荧光显微镜采集图像，并将其导入到ImageJ 分析软件（NIH）中。

3 统计学处理

所有数据先进行正态性检验，数据符合正态分布后，进行方差齐性检验，最后使用SPSS 17.0 进行单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05可认为差异具有统计学意义。

结 果

1 西奥罗尼抑制人胶质瘤细胞增殖并增强其放射敏感性

既往报道西奥罗尼可以通过抑制慢性炎症相关激酶CSF-1R 来起作用［8］。通过Western blot 发现，随着药物浓度的增加，CSF-1R在U251细胞的表达量没有明显改变，而p-CSF-1R 的水平逐渐降低（图1A）。通过CCK-8 实验分析验证了西奥罗尼对U251 细胞和T98G 细胞活力的抑制作用，结果如图1B、C 所示，随着西奥罗尼浓度的增加，U251 细胞和T98G 细胞的活力受到明显抑制，计算出U251 细胞和T98G 细胞的IC50分别为7.773 μmol/L 和24.68 μmol/L，并确定了30%的抑制率对应的浓度2.5 μmol/L 可用作进一步实验的药物浓度。

用X 射线（0、2、4 和6 Gy）或联合西奥罗尼（2.5 μmol/L）处理U251 细胞和T98G 细胞，并通过集落形成的实验结果分析了细胞存活效率。U251 细胞单纯X 射线辐照组在不同辐照剂量下的集落形成率分别为（16.670±3.987）%、（7.667±1.627）%、（3.889±0.385）%和（0.917±0.260）%，联合西奥罗尼组在不同辐照剂量下的集落形成率分别为（9.167±1.942）% 、（3.803±0.629）% 、（1.722±0.509）% 和（0.875±0.354）%。T98G 细胞单纯X 射线辐照组在不同辐照剂量下的集落形成率分别为（14.580±0.882）% 、（6.367±0.741）% 、（4.056±0.434）% 和（2.000±1.444）%，联合西奥罗尼组在不同辐照剂量下的集落形成率分别为（6.333±1.710）%、（4.167±0.221）%、（1.167±0.962）%和（0.583±0.150）%。对集落形成结果进行L-Q 拟合，结果表明西奥罗尼联合X 射线组的抑制增殖作用比单独X 射线组更明显，计算出西奥罗尼对U251 细胞和T98G 细胞的放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）分别为1.387 和1.384，这表明西奥罗尼可增强人胶质瘤细胞的放射敏感性，见图1D、E。

Figure 1. Chiauranib inhibited the proliferation of glioma cells and enhances their radiosensitivity. A：the protein level of p-CSF-1R in U251 cells exposed to different concentrations of chiauranib was detected by Western blot；B and C：the viabily of U251 and T98G cells exposed to chiauranib was measured by CCK-8 assay；D and E：the linear-quadratic fitting curves of colony formation of U251 and T98G cells treated with different doses of irradiation. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L group.图1 西奥罗尼抑制人胶质瘤细胞的增殖并增强其放射敏感性

2 西奥罗尼增强辐射诱导的人胶质瘤细胞G2/M 期阻滞

为探索西奥罗尼联合X 射线增强胶质瘤细胞放射敏感性的机制，分别用流式细胞术和Western blot检测细胞周期相关蛋白水平的变化。将U251 细胞和T98G 细胞单独用X 射线（4 Gy）或西奥罗尼（2.5 μmol/L）或二者联合联合处理24 h 后，用流式细胞术进行细胞周期检测。与对照组相比，4 Gy 辐照组、西奥罗尼2.5 μmol/L 组以及西奥罗尼2.5 μmol/L 联合4 Gy 辐照组均引起G2/M 期阻滞，并且联合组的G2/M期阻滞作用更强［U251：（23.96±1.18）%；T98G：（6.54±0.13）%］，见图2A。Western blot 结果提示，与对照组对比，周期相关蛋白p-Cdc2 的水平在其余3组均降低，并且联合组降低最明显，见图2B。

Figure 2. Chiauranib combined with X-ray irradiation caused cell cycle arrest in glioma cells. A：the cell cycle distribution of U251 and T98G cells was measured by flow cytometry；B：the protein levels of Cdc2 and p-Cdc2 in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vehicle group.图2 西奥罗尼联合X射线造成人胶质瘤细胞发生细胞周期阻滞

3 西奥罗尼联合X 射线促进人胶质瘤细胞发生凋亡

为了进一步探索西奥罗尼联合X 射线增强胶质瘤细胞放射敏感性的机制，将U251 细胞单独用X 射线（4 Gy）或西奥罗尼（2.5 μmol/L）处理，或二者联合处理48 h 后，与对照组相比，X 射线辐照组、西奥罗尼组和联合组均检测到更多的凋亡细胞，并且联合组检测到最多的凋亡细胞［U251：（21.22±0.38）%；T98G：（21.32±0.64）］，见图3A。此外，我们通过Western blot 检测了多种与细胞凋亡相关的蛋白，与对照组相比，其余3组的caspase-3和PARP 的蛋白水平的差异没有统计学显著性，但是cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白水平显著升高，见图3B。

Figure 3. Chiauranib combined with X-ray irradiation induced apoptosis of glioma cells. A：the apoptosis of U251 and T98G cells was detected by flow cytometry；B：the protein levels of cleaved caspase-3 and cleaved PARP in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs vehicle group.图3 西奥罗尼联合X射线诱导人胶质瘤细胞发生细胞凋亡

4 西奥罗尼联合X射线促进DNA损伤和延缓DNA修复进程

免疫荧光实验结果显示，在30 min，γH2AX 荧光灶点在单纯辐照组和联合组中均十分明显，并且联合组的荧光强度更强；在6 h 和24 h，γH2AX 荧光灶点在X 射线辐照组中逐渐减少，而在联合组中可以观察到γH2AX 荧光灶点，进而证明了西奥罗尼延迟了U251 细胞和T98G 细胞的DNA 损伤修复进程，见图4A、B。随后，通过Western blot 检测了DNA 损伤修复的关键蛋白，结果提示CHK2和AKT在4组中的变化不显著，但是联合组的p-CHK2 和γH2AX 的蛋白水平显著升高，p-AKT 的蛋白水平显著降低，见图4C。

Figure 4. Chiauranib combined with X-ray irradiation inhibited the DNA damage and repair process of glioma cells. A：the process of DNA damage and repair in U251 cells was observed by immunofluorescence；B：the process of DNA damage and repair in T98G cells was observed by immunofluorescence；C：the protein levels of γH2AX，p-AKT and p-CHK2 in U251 cells treated with chiauranib（2.5 μmol/L）or/and X-ray（4 Gy）were detected by Western blot. Mean±SEM. n=3.#P＜0.05 vs 4 Gy group；*P＜0.05 vs vehicle group.图4 西奥罗尼联合X射线抑制人胶质瘤细胞DNA损伤和修复进程

讨 论

胶质瘤是一种血运丰富的肿瘤［8，12］。西奥罗尼是一种新型的多靶点抑制剂，可通过抑制血管生成、有丝分裂和慢性炎症来抑制肿瘤的生长［13］。除此之外，它的抑制作用具有很高的选择性，对其他正常功能激酶、蛋白质和离子通道的影响很小［13］。西奥罗尼也通过诱导VEGFR2 的失活及其下游信号级联以促进凋亡来抑制AML 细胞的增殖［9］。还有研究发现，西奥罗尼可以通过抑制Aurora B 的体内抗有丝分裂作用而导致细胞G2/M期阻滞［12］。由于西奥罗尼的抑制血管生成等作用可以抑制肿瘤生长，因此西奥罗尼与其他治疗方式（如放疗）联合使用有可能会获得更好的抗肿瘤作用。因此本研究的目的是探索西奥罗尼对人胶质瘤细胞的放射增敏作用及其机制。本研究通过CCK-8 实验发现，随着西奥罗尼的药物浓度增高，人胶质瘤细胞的生长明显受到抑制，结合集落形成实验的结果，可以认定西奥罗尼具有抑制人胶质瘤细胞增殖的作用。

放疗作为胶质母细胞瘤重要的治疗方式，在临床上应用广泛。但是提高放射总剂量会对肿瘤组织周边的正常组织造成损害，因而放疗增敏剂成为了胶质瘤治疗的研究热点。为进一步探索西奥罗尼是否可以增加胶质瘤U251 的放射敏感性，本研究进行了集落形成实验，将结果绘制成生存曲线，通过线性-二次方程算出了放疗SER。从而证明西奥罗尼可以增加人胶质瘤细胞放射敏感性的作用。除此之外，本研究通过流式细胞术检测凋亡情况证实了西奥罗尼联合X 射线能显著提高细胞凋亡率。caspase-3 是caspase 蛋白家族的一员，在细胞凋亡中发挥重要作用［14］。PARP 是caspase-3 裂解的基本底物之一，它是一种DNA 结合酶，其表达提示DNA 双链发生断裂［15］。本研究通过Western blot 检测证实caspase-3 和PARP 的蛋白水平在4 组没有明显差异，而cleaved caspase-3和cleaved PARP 的水平在X 射线辐照组、西奥罗尼组和联合组中均显著增高，并且联合组中表达量最高，这意味着与单纯X 射线辐照组相比，西奥罗尼联合X 射线能更容易诱导U251 细胞发生凋亡。

DNA 双链发生断裂，是放疗杀伤肿瘤的重要机制［16-17］。肿瘤细胞启动DNA 损伤修复机制，需要激活细胞周期检查点［18-19］。我们通过细胞周期检测发现，与对照组相比，X 射线辐照组、西奥罗尼组和联合组都出现了G2/M 期阻滞，并且联合组的G2/M 期阻滞的细胞最多，而S 期细胞最少。众所周知，肿瘤细胞在G2/M 期对X 射线最敏感，G1期相对不敏感，而S期最不敏感［20］，因而西奥罗尼可以作为良好的放疗增敏剂。Cdc2 参与周期检查点调控，当其调节异常时，可能导致肿瘤细胞的染色体不稳定［21］。通过Western blot 检测Cdc2 蛋白的水平发现，与对照组相比，其他3组Cdc2的水平不变，而p-Cdc2的水平都降低，并且联合组的水平最低。通过免疫荧光实验验证了西奥罗尼联合X 射线，可以诱导人胶质瘤U251细胞DNA 损伤和延迟修复进程。γH2AX 是募集DNA 损伤的载体可以募集下游修复蛋白至DNA 损伤部位进行修复［6］。通过Western blot 检测γH2AX、AKT 和CHK2等蛋白，进一步证明了西奥罗尼联合X射线能诱导U251 细胞发生DNA 损伤和延迟DNA 修复进程。

综上所述，西奥罗尼可以抑制人胶质瘤细胞的增殖，并且增强其放射敏感性。研究发现西奥罗尼是通过诱导人胶质瘤细胞发生G2/M 期阻滞、促进细胞凋亡、诱导DNA 损伤及延迟修复进程来起作用的。本研究为西奥罗尼作为潜在放疗增敏剂在临床胶质瘤治疗上的应用提供实验基础和理论依据。