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GTP酶免疫相关蛋白5在调控肺炎克雷伯菌感染大鼠致病性CD4+T细胞发育中的作用*

2021-10-20王艳丽黄中炎付晓荣汪晓婷

中国病理生理杂志 2021年9期
关键词:糖酵解活化发育

张 臣, 王艳丽, 黄中炎, 付晓荣, 王 勉, 张 丽, 汪晓婷△

[1武汉市武昌医院(武汉科技大学附属武昌医院)儿科,湖北武汉 430063;2华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)小儿呼吸二内科,湖北武汉 430016]

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是一种革兰氏阴性杆菌,通常存在于下消化道。在免疫防御受损或气道清除机制受损的患者中,KP 可引起下呼吸道的严重感染[1]。目前,关于KP 诱导下呼吸道感染的发病机制尚未完全清楚。最近的研究表明,KP 感染与Th1/Th17 CD4+T 细胞的存在有关[2]。此外,KP 感染患者的肺部、痰液和血液中白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)或IL-17A+CD4+T细胞水平与疾病严重程度相关[3]。然而,导致KP 相关感染的遗传和环境因素仍不清楚。GTP 酶免疫相关 蛋 白5(GTPase of immunity-associated protein 5,GIMAP5)对淋巴细胞的存活至关重要,GIMAP5缺陷的CD4+T细胞在抗原刺激下表现出生存受损和DNA损伤增加[4]。在啮齿类动物和人类受试者中,GIMAP5丧失功能突变会导致淋巴细胞减少,免疫耐受丧失,随后出现自身免疫性疾病[5]。在GIMAP5缺陷小鼠中,表现为CD4+T 细胞驱动的结肠炎[6]。但目前尚不清楚KP感染是否通过调节GIMAP5的活性来控制T 细胞发育。因此,本项工作以大鼠CD4+T 细胞为研究对象,探讨KP感染对细胞中GIMAP5表达、T细胞激活及Th17和Th1细胞体外发育的影响。

材 料 和 方 法

1 材料

动物:从北京协和医学院实验动物研究所获得20 只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠[SPF 级,200~250 g,3 月龄,生产许可证号为SCXK(京)2017-0005]。动物在标准条件下饲养,均可自由获得标准饲料和水。

菌株:KP 菌株购自中国科学院微生物研究所,在营养琼脂培养基上培养,用生理盐水稀释为2.4×1011CFU/L,在动物体内进行KP诱导。

2 方法

2.1 细胞分离和培养 使用CD4+T 细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从大鼠脾细胞中获得CD4+T 细胞。将细胞接种在含10%热灭活胎牛血清(Sigma-Aldrich)、55 μmol/L 2-巯基乙醇(Gibco)、1×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素(Sigma-Aldrich)的RPMI-1640 培养液(含L-谷氨酰胺;Gibco)中,加入抗CD3和抗CD28抗体(浓度分别为1和2 mg/L)进行体外细胞刺激,观察不同刺激时间(24、48 和72 h)对CD4+T细胞GIMAP5 表达的影响。为了诱导大鼠T 细胞亚群,在下列细胞因子和抗体的存在下激活细胞[4]:对于Th1细胞,使用20 μg/L IL-12和5 mg/L 抗大鼠IL-4抗体;对于Th17 细胞,使用0.5 μg/L 转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、50 μg/L IL-6、10 μg/L IL-23、10 μg/L IL-1β、5 mg/L 抗大鼠IFN-γ 抗体和5 mg/L 抗大鼠IL-4 抗体;对于调节性T 细胞(regulatory T cells,Treg),使用5 mg/L TGF-β。抗体从BD Biosciences 购买,而细胞因子则从Miltenyi Biotech、Immunotools 或BioLegend 购买。对于CD4+T细胞活化和发育实验,将CD4+T 细胞分为对照(control、CTRL)组、KP 组和KP+GIMAP 组。除对照组外,将培养至对数生长期的KP 用PBS 稀释至2.4×1011CFU/L,并按感染复数100∶1 的比例混合细菌与CD4+T 细胞共孵育6 h。此外,KP+GIMAP5 组加入GIMAP5重组蛋白(广州锐博生物科技有限公司设计并合成)25 μmol/L,在37 ℃下预培养72 h。然后,各组加入抗CD3和抗CD28抗体(浓度分别为1和2 mg/L)体外刺激细胞48 h。收集细胞,进行以下测试。

2.2 Western blot检查 收集培养细胞并在Laemmli样品缓冲液中裂解,然后在95 ℃条件下加热5 min。用BCA 蛋白定量分析试剂盒(Thermo Scientific)测量蛋白浓度。蛋白样品在SDS-PAGE 上分离,并转移到PVDF 膜上。用1∶1 000 稀释的Ⅰ抗(GIMAP5 和GAPDH)和1∶2 000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG抗体(均购自Cell Signaling Technology)检测蛋白表达水平。以GAPDH为内参照。

2.3 RT-qPCR 实验 使用Purelink RNA Mini 试剂盒(Invitrogen)分离RNA。利用高容量cDNA 反转录试剂盒(Applied Biosystems)将RNA 转化为cDNA,并在Applied Biosystems 7500 型荧光定量PCR 仪上进行RT-qPCR 检测。mRNA 表达水平用2-ΔΔCt法计算。GAPDH 的正向引物序列为5′-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′,反向引物序列为5′-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3′;GIMAP5 的 正 向 引 物 序 列 为5′-TACCAGGAGCCCATTCACAAC-3′,反向引物序列为5′-GCCACAGGACATCAGCCAAGAA-3′。

2.4 流式细胞术 除了早期IL-2 生成的评估在激活后24 h 进行外,其他所有的流式细胞术都是在激活后3 d 进行的。所有流式抗体采用1∶200 稀释。为了分析细胞增殖,细胞在激活前用CellTrackerTMViolet(CTV;Invitrogen)进行预染色。用CTV 稀释法评估细胞增殖水平。为了评估T 细胞的活化,收集洗涤细胞,并用抗大鼠CD44 和CD25 抗体染色。细胞内细胞因子染色:收集细胞并洗涤,用50 mg/L PMA+1 mg/L 离子霉素+10 mg/L 布雷菲尔德菌素A(均购自Sigma-Aldrich)重新刺激,4 h 后,冲洗细胞,用固定和渗透缓冲液(BioLegend)固定/渗透,并用抗大鼠IL-2、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)和IL-17A 染色。对于Treg 检测,首先用抗大鼠CD25 抗体染色,然后用Foxp3/转录因子染色缓冲液组(Invitrogen)固定/渗透细胞,并用抗大鼠Foxp3 抗体孵育。所有样本均在FACS Canto Ⅱ细胞分析仪(BD Biosciences)上处理。使用FlowJo软件对采集的数据进行分析。

2.5 RNA 测序与转录组学分析 RNA 测序与转录组学分析由北京博奥生物有限公司完成。总RNA使用Qubit 2.0(Thermo Fisher Scientific)进行量化。采用独创性路径分析(Qiagen)进行无偏路径分析。只有计算出KP 处理组与Th0 对照组差异表达变化>±1 倍且P<0.05 的基因才被考虑用于通路分析。为了生成特定基因集的热图,使用了Morpheus 软件(Broad Institute)。基因列表是从公开可用的基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)数据库(Broad Institute)中获得的,这些基因集的折叠改变基因表达在KP 处理的Th0 和对照Th0 RNAseq 数据中被量化。只有KP 处理组与对照组样本差异表达变化>±1倍且调整后P<0.05的基因才被纳入显示原始读取计数值的热图中。

3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析,以均值±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用Student 双尾检验,多组间比较采用方差分析和Sidak多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CD3/CD28 刺激后CD4+T 细胞中GIMAP5 的表达上调

CD4+T 细 胞 受CD3/CD28 刺 激 后,GIMAP5 的mRNA 和蛋白水平与刺激前相比均显著上调(P<0.05),见 图1A、B。此 外,CD3/CD28 刺 激 导 致GIMAP5在细胞中呈时间依赖性积累,见图1C。

Figure 1. CD3/CD28 activation induced the up-regulation of GIMAP5 expression in CD4+ T cells of rats. A:relative mRNA level of GIMAP5 in resting and activated CD4+T cells was detected by RT-qPCR;B:Western blot showed the expression and quantitative analysis of GIMAP5 protein in CD4+ T cells after activation;C:the protein expression of GIMAP5 in activated CD4+T cells was analyzed by Western blot. Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs resting group.图1 CD3/CD28激活诱导大鼠CD4+T细胞GIMAP5表达上调

2 KP感染阻断大鼠CD4+T细胞活化

为了测试KP 感染对T 细胞功能的影响,本研究用KP 感染CD4+T 细胞。结果显示,在CD3/CD28 激活期间,用KP 处理大鼠CD4+T 细胞可降低活化T 细胞中GIMAP5 的水平,见图2A。然后研究分析了KP感染对T 细胞功能的影响。在CD3/CD28 刺激后24 h,与对照组细胞相比,KP 感染组中产生IL-2 的细胞显著减少(P<0.01),加入GIMAP5 重组蛋白可恢复IL-2 的产生(P<0.05),见图2B。与这些结果一致,KP处理抑制大鼠CD4+T细胞的增殖(P<0.01),加入GIMAP5 重组蛋白促进了CD4+T 细胞增殖(P<0.01),见图2C、D。

Figure 2. KP infection blocked the CD4+ T cell activation in rats. A:Western blot was used to detect the protein expression of GIMAP5 in the CD4+T cells after KP treatment;B:the percentage of IL-2+cells after KP treatment was detected by flow cytometry;C:representative flow cytometry chart showing fluorescent CellTracer ™Violet to assess T cell proliferation;D:FlowJo software was used to calculate the division index to quantify T cell proliferation. Measn±SD. n=6.**P<0.01 vs control(CTRL)group;#P<0.05,##P<0.01 vs KP group.图2 KP感染阻断大鼠CD4+T细胞活化

3 KP感染促进Myc、HIF-1α和mTORC1信号转导

独创性路径分析预测了KP 参与上调T 细胞激活的关键信号通路,其中包括Myc、HIF-1α 和mTOR通路,见图3A。据此,基因表达分析证实,KP感染在体外促进了CD4+T 细胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所调节的基因的上调,见图3B。由于HIF-1α、Myc 和mTORC1 是T 细胞有氧糖酵解和Warburg 样代谢的关键调节因子[7],进一步RNA序列分析结果表明,KP感染处理显著促进了激活后T 细胞中几种糖酵解基因的上调,见图3C。

Figure 3. KP infection promoted HIF-1α,Myc and mTORC1 signaling transduction. A:original pathway analysis predicted that KP up-regulated Myc,HIF-1α and mTOR regulatory pathways;B:the thermography showed the expression of the genes regulated by Myc,HIF-1α and mTOR in T cells activated by DMSO(Th0 CTRL)or KP(Th0 KP);C:the thermography showed the expression of glycolytic genes in Th0 CTRL and Th0 KP cells.图3 KP感染促进了HIF1-α、Myc和mTORC1信号转导

4 PK感染促进Th17和Th1细胞的发育

流式细胞术分析显示,与对照组相比,KP 感染后Th17 细胞和Th1 细胞的比例显著升高(P<0.01),加入GIMAP5 重组蛋白可阻断Th17 和Th1 细胞的发育,见图4A、B。重要的是,本研究还观察到KP 感染耗尽Treg 群体(P<0.01),加入GIMAP5 重组蛋白可诱导Treg产生(P<0.01),见图4C。

Figure 4. Flow cytometry was used to evaluate the percentages of Th17+ cells(A),Th1 cells(B),and Treg(C). Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs CTRL group;#P<0.05,##P<0.01 vs KP group.图4 流式细胞术测定Th17细胞、Th1细胞和Treg的比例

讨 论

KP 因其可引起广泛感染及高水平抗生素耐药性而备受关注[8]。作为对KP 感染的反应,宿主会触发强烈的体液和细胞免疫反应,包括肺固有层CD3+CD4+T 细胞增多和T 细胞浸润。小鼠肺部KP 感染是最早证明IL-17A对宿主细胞防御外细菌感染重要性的传染病模型之一[9]。近年来,研究显示KP 感染的CD4+T细胞在抗原刺激下表现出生存受损和DNA损伤增加[10]。GIMAP5蛋白主要在淋巴细胞中表达,并在发育、选择和稳态过程中调节淋巴细胞存活[11]。然而,目前关于KP 感染是否通过调节GIMAP5 的活性来控制T细胞活化却从未被研究过,尤其是在T细胞亚群的背景下。本研究显示GIMAP5在CD3/CD28刺激后表达上调,并积聚在CD4+T 细胞中;KP 感染显著降低了GIMAP5 表达,严重影响T 细胞活化,并促进了促炎性Th17和Th1细胞的体外发育。

GIMAP5可以被转运到增殖细胞的细胞核,发挥不同的功能,如组蛋白磷酸化和基因转录调控,包括调控Myc转录和与HIF-1α相互作用以促进HIF-1α依赖基因的表达,编码参与糖酵解的酶[4]。GIMAP5 也被证明通过mTORC1抑制富含脯氨酸的AKT1底物1的磷酸化或通过减少丝氨酸的合成来调节转化细胞中mTORC1的活性,且GIMAP5可在增殖细胞中维持mTORC1 功能[12]。本研究结果表明,GIMAP5 的活性可能通过控制HIF-1α、mTORC1 和Myc 的功能,以及T 细胞受体激活的CD4+T 细胞中有氧糖酵解的参与而调控,这些是其激活的关键因素[7]。值得注意的是,静息T细胞细胞核中GIMAP5的水平较低,先前的研究表明HIF-1α和Myc的活性可能由mTORC1自身控制[13]。因此,抑制GIMAP5的活性可以阻断HIF-1α和Myc在CD3/CD28刺激下的高表达水平。这些结果可以解释KP 体外感染促进了CD4+T 细胞中Myc、HIF-1α 和mTOR 所诱导的基因的上调。因此,KP 感染可能对T细胞代谢有更广泛的影响。

本研究还表明,KP 感染诱导促炎性Th17 和Th1细胞的发育,且抑制Treg 生成,从而抑制体内自身免疫。先前的研究表明,诱导mTORC1、Myc 和HIF-1α可以抑制炎症条件下Foxp3+T细胞的发育[14-15]。其他研究表明,糖酵解和mTORC1/HIF-1α 活性抑制有利于Treg 的生成[16]。而抑制有氧糖酵解可限制小鼠模型和人类疾病中T 细胞介导的Th17 生成和发展[17]。鉴于本研究结果表明KP在体外可阻断TGF-β诱导的Treg,因此需要进一步研究GIMAP5 在Treg 生成和功能中的重要性。此外,为了进一步确认GIMAP5在介导KP 感染引起的T 细胞激活和致病性中的作用,应进一步在体内模型中分析GIMAP5基因缺失对KP感染大鼠T细胞功能的影响。

综上所述,影响GIMAP5 活性可能是限制KP 感染诱导T 细胞致病性的一个潜在途径。本研究支持这样一种观点,即通过上调T细胞中GIMAP5的表达来限制Th1/Th17 的发育是治疗KP 感染的一种有价值的方法。

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