山柰酚减轻慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的炎症反应*

刘彩虹， 杨红辉， 卢俊娟

（中南大学湘雅三医院呼吸与危重症医学科，湖南长沙 410013）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种以呼吸气流受阻为主要特征的慢性气道炎症性疾病，并伴有各种炎症细胞浸润和气道重塑，其已成为影响约6 亿多人群的全球公共卫生问题之一［1］。据流行病学调查显示，40岁以上人群的COPD 发病率为8.2%，且随着人口老龄化、吸烟、粉尘和感染等因素影响，其发病率和死亡率有上升趋势，预计2030 年，COPD 将成为全球第三大死亡原因［2］。临床常用药糖皮质激素、β2受体激动剂、抗胆碱剂、平滑肌舒张剂和抗生素等药物虽对缓解COPD 症状有益，但对疾病的预后无明显改善［3］。因此，迫切需要寻找或开发治疗COPD 新的替代药物。

山柰酚（kaempferol，Kae）是从姜科植物山柰和小檗科植物窝儿七的根茎以及豆科植物槐树的干燥种子中提取的一种黄酮类化合物，其具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎等广泛的药理学活性［4-5］。Molitorisova等［6］报道，山柰酚能降低卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症模型豚鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BLAF）中促炎因子白细胞介素5（interleukin-5，IL-5）、IL-13、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）及嗜酸性粒细胞数量，并改善哮喘症状。但是，山柰酚在COPD 中发挥的作用及机制尚不清楚。因此，本研究通过构建COPD 小鼠模型，检测山柰酚对COPD 模型小鼠肺组织的组织形态改变、BLAF 中促炎性细胞因子含量、肺组织中氧化应激标志物水平的影响，并探讨其机制。

材 料 和 方 法

1 实验试剂

山柰酚（纯度≥98.0%）购自Sigma；小鼠单核细胞 趋 化 蛋 白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β 和IL-5 ELISA 试剂盒均购自江苏凯基生物技术有限公司；谷胱甘肽（glutataione，GSH）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；苏木精和伊红（HE）染色试剂盒购自武汉百皓天生物科技有限公司；BCA 蛋白含量检测试剂盒、ECL 化学发光试剂盒、GAPDH 抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）和Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔IgG（H+L）均购自上海碧云天生物技术有限公司；p-NF-κB p65（Ser536）抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

2 方法

2.1 COPD 小鼠模型建立和实验方案 24 只6 周龄

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（18～20 g）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证编号为SCXK（湘）2019-0004，饲养于中南大学湘雅二医院实验动物中心，在实验前，适应性饲养1 周。用随机数表法将小鼠随机分为4组（每组6只）：对照（control）组、模型组（COPD 组）和低、高剂量山柰酚治疗组（COPD+25 mg/kg Kae 组和COPD+100 mg/kg Kae 组）。对照组小鼠在正常条件下饲养。模型组小鼠暴露于香烟烟雾暴露环境装置系统（自制烟雾暴露箱100 cm×80 cm×30 cm，一侧开出烟口，另一侧开小孔放置香烟，顶部设置5 cm×30 cm 观察窗）中，COPD 小鼠造模方法根据文献［7］所述：10支/日，箱中烟雾浓度控制在7%左右，暴露时间持续40 min，每间隔5 min 敲打烟箱壁1 次以避免小鼠扎堆造成吸烟量不均匀，持续12 周。低和高剂量山柰酚治疗组在烟雾暴露前2 h分别灌胃25和100 mg/kg山柰酚。

2.2 BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 含量测定 第13 周，麻醉小鼠，按照文献［7］方法，用导管插入右肺中叶，用0.8 mL 的37 ℃PBS 灌洗3 次，每次回收量约0.5～0.6 mL，合并3 次回收的灌洗液以1 000×g离 心5 min，收集上清液。取BALF 的上清液，根据ELISA 试剂盒说明书步骤检测BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 的水平。待底物溶液反应终止后，使用SynergyTMH4 Hybrid 型多功能酶标仪（BioTek）测波长450 nm 处的吸光度（A）值。并根据标准曲线计算BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α的含量。

2.3 组织病理学分析 收集BALF 后，解剖并收集左肺组织，肺组织用石蜡包埋。取肺石蜡组织制作5 μm 厚的石蜡切片，根据HE 染色试剂盒说明书步骤行HE 染色。每个样品切片任取5 个视野，根据文献［8］描述方法，对间质炎症、肺泡壁增厚、支气管周炎症和间质水肿影响的区域，进行肺组织损伤评分。

2.4 肺组织中GSH、NO、MDA和SOD水平测定 取肺组织在冰上匀浆，用BCA 蛋白含量检测试剂盒测定匀浆液中的蛋白浓度，然后根据试剂盒说明书步骤检测匀浆液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量。然后根据匀浆液中的蛋白浓度，将匀浆液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量标准化为肺组织中GSH、NO、MDA和SOD的水平。

2.5 免疫荧光 取肺组织，脱蜡至水后，在0.2%Triton X-100 中透化，用10%山羊血清封闭30 min，然后用1∶100稀释的抗p-NF-κB p65抗体4 ℃孵育过夜；PBS洗涤后，用1∶100稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（H+L）避光室温温育1 h，用DAPI 染核15 min，荧光显微镜下观察。

2.6 Western blot 取肺组织，用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，用蛋白含量检测试剂盒对蛋白定量。蛋白经SDS-PAGE 后，将蛋白电转至PVDF 膜，PVDF膜经封闭后，室温分别孵育抗p-NF-κB p65 抗体（1∶1 000稀释）1.5 h，TBST洗膜3次后，室温孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶2 000 稀释）45 min，TBST 洗膜3 次后，利用ECL 化学发光试剂盒对目的条带显影，以GAPDH 为内参照，采用Image-Pro Plus软件测量目的条带的光密度。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6 软件将实验中所得的数据进行统计分析。数据用均数±标准差（mean±SD）表示，多组之间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 山柰酚对COPD小鼠肺组织形态学的影响

HE 染色显示，对照组小鼠肺泡结构正常，肺泡间隔规则有序；COPD 模型组小鼠肺泡壁增厚，肺泡间隔不规则甚至不可辨认，在病变的肺泡周围可见大量炎症细胞浸润和出血点，支气管腔壁增厚，在病变支气管周可见大量炎症细胞浸润且支气管腔内黏液填充或闭塞；低剂量山柰酚治疗组小鼠肺组织改变相对模型组有所改善，肺组织形态学主要表现为：部分肺泡壁增厚和肺泡间隔不规则，病变的肺泡周围可见炎症细胞浸润和小量出血点，在病变支气管周可见炎症细胞浸润且支气管腔内黏液分泌较多；高剂量山柰酚治疗组绝大多数肺泡结构趋向正常，肺泡间隔趋向规则，在少量肺泡壁增厚的肺间质可见少量炎症细胞浸润，见图1A。肺组织损伤评分结果显示，与对照组比较，COPD 模型组小鼠肺组织损伤评分显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，低和高剂量山柰酚治疗组小鼠肺组织损伤评分均显著降低，且以高剂量山柰酚治疗组最为显著（P＜0.01），见图1B。

Figure 1. Effect of kaempferol（Kae）on histomorphological changes of lung tissues in COPD mice（HE staining，scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs COPD group.图1 山柰酚对COPD小鼠肺组织形态学的影响

2 山柰酚对COPD 小鼠BLAF 中促炎症因子水平的影响

ELISA 结果显示，与对照组比较，COPD 模型组小鼠BALF 中促炎症因子IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNFα 水平均显著升高（P＜0.01）；与COPD 模型组比较，低和高剂量山柰酚治疗组小鼠BALF 中上述促炎症因子水平均显著降低（P＜0.05），且以高剂量山柰酚治疗组降低最为显著（P＜0.01），见图2。

Figure 2. Effect of kaempferol（Kae）on the levels of pro-inflammatory factors in BLAF of COPD mice. IL-1β（A），IL-5（B），MCP-1（C）and TNF-α（D）levels in BLAF of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs COPD group.图2 山柰酚对COPD小鼠BLAF中促炎症因子水平的影响

3 山柰酚对COPD 小鼠肺组织中氧化应激标志物水平的影响

与对照组比较，COPD 模型组小鼠肺组织中MDA 和NO 水平均显著升高（P＜0.01），SOD 和GSH水平显著降低（P＜0.01）；与COPD 模型组比较，低和高剂量山柰酚治疗组小鼠肺组织中MDA 和NO 水平均显著降低（P＜0.01），SOD 和GSH 水平则显著升高（P＜0.01），且以高剂量山柰酚治疗组变化最为显著（P＜0.01），见图3。

Figure 3. Effect of kaempferol（Kae）on the levels of oxidative stress markers in lung tissue of COPD mice. MDA（A），SOD（B），GSH（C）and NO（D）levels in lung tissues of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs COPD group.图3 山柰酚对COPD小鼠肺组织中氧化应激标志物水平的影响

4 山柰酚对COPD小鼠肺组织NF-κB活化的影响

免疫荧光结果显示，对照组小鼠肺组织中可见极少量p-NF-κB p65 阳性细胞；COPD 模型组小鼠肺组织中可见大量p-NF-κB p65阳性细胞；低和高剂量山柰酚治疗组小鼠肺组织中p-NF-κB p65 阳性细胞数较COPD 模型组有所降低，以高剂量山柰酚治疗组尤为明显，见图4A。Western blot 结果显示，与对照组比较，COPD 模型组小鼠肺组织中p-NF-κB p65蛋白水平显著增加（P＜0.01）；与COPD 模型组比较，低和高剂量山柰酚治疗组小鼠肺组织中p-NF-κB p65 蛋白水平均显著降低（P＜0.01），且以高剂量山柰酚治疗组最为显著（P＜0.01），见图4B。

Figure 4. Effect of kaempferol（Kae）on the activation of NF-κB in lung tissue of COPD mice. A：representative images of immunofluorescence of p-NF-κB p65（scale bar=100 μm）；B：Western blot assay of p-NF-κB p65 protein. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs COPD group.图4 山柰酚对COPD小鼠肺组织NF-κB活化的影响

讨 论

COPD 的主要危险因素为长期吸烟。香烟烟雾中含有如一氧化碳、尼古丁、苯酚和醛等大量有害物质，这些物质可导致气道以及肺实质中炎症因子生成以及炎症细胞浸润，从而引起炎症损伤以及气道重塑和小气道阻塞，造成肺功能障碍［9-10］。抑制气道和肺实质中炎症反应能减轻COPD 症状和气道重塑［11］。山柰酚已被证明在哮喘、急性气管炎和急性肺损伤等多种模型中具有抑制气道和肺实质炎症反应 以 及 抑 制 黏 液 蛋 白 合 成 的 作 用［6，12-16］，而 其 对COPD 模型小鼠的影响并不清楚。本研究结果显示，山柰酚不仅能改善香烟烟雾诱导的COPD 模型小鼠肺组织形态表现，还能显著降低COPD 小鼠BALF 中促炎性因子MCP-1、TNF-α、IL-1β 和IL-5 水平。NFκB 是最重要的炎症信号之一，文献［17-18］证实，NF-κB途径的激活与COPD 的发生和发展密切相关，长期香烟烟雾暴露能使肺组织中NF-κB 激活，而NF-κB活性过度激活能进一步促进肺组织中炎症级联反应和气道重塑，进而加重COPD 症状。且已有报道［14-16］显示，山柰酚可通过抑制NF-κB 活性来降低LPS 和H9N2 猪流感病毒诱导的急性肺损伤。本研究结果也显示，经山柰酚治疗后，COPD 小鼠肺组织中p-NFκB p65蛋白水平明显降低，提示山柰酚能降低COPD小鼠肺组织中NF-κB信号活化水平。

氧化应激不仅是COPD 发病机制中的一个主要的诱发因素，也是促进COPD 进展的重要驱动因素之一［19］。香烟烟雾中的外源性氧化剂以及吸烟导致的肺部炎症细胞和结构细胞生成的内源性活性氧，可以破坏机体的抗氧化剂/氧化剂平衡，导致COPD患者的肺部氧化应激增加［19-20］。氧化应激能放大肺部和气道的慢性炎症，并能直接损害肺组织，诱导肺气肿形成，从而导致气流阻塞［9，20］。研究表明［9，20-21］，抑制氧化应激反应能减轻COPD 症状并能阻止气道重塑。本研究结果显示，山柰酚能降低COPD 模型小鼠肺组织中MDA 和NO 水平，并能升高SOD 和GSH 水平，提示山柰酚能在一定程度上修复COPD模型小鼠肺组织中抗氧化剂/氧化剂失衡，降低肺组织中氧化应激反应。

综上所述，山柰酚对小鼠COPD 能发挥治疗作用，且这一作用可能与其抗炎、抗氧化和抑制NF-κB信号通路相关。