消痔洗剂提取工艺研究

丁美林 宗 阳 徐玲玲 周建华 蒋 勇 江建国*

1.江苏省如东县中医院，江苏 如东 226400；2.苏州市中医院，江苏 苏州 215000；3.上海中医药大学，上海 200120

消痔洗剂为江苏省如东中医院的外用经验方，由黄柏、虎杖、败酱草、鱼腥草等六味药组成，具有清热利湿解毒、散瘀止痛、去腐消肿的功效，临床用于肛肠病术后创面疼痛、出血、肛缘水肿、创面恢复。经多年临床应用并验证，该洗剂使用方便、疗效良好，尚未发现明显不良反应，年使用量大于12000瓶。方中黄柏为君药，鱼腥草为臣药。现代药理研究[1-3]表明黄柏对皮肤有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，其中盐酸小檗碱抗炎作用研究较多。鱼腥草挥发油是发挥抗炎、抗菌作用重要成分[4-5]。

研究根据《中国药典》(2020年版)四部项下挥发油测定法[6]，以挥发油提取体积、提取量为考察指标，通过单因素考察，确定鱼腥草挥发油最佳提取工艺。水提取工艺提取，根据处方分析以君药黄柏中盐酸小檗碱为指标成分，采用高效液相色谱法(HPLC)法结合正交试验，以盐酸小檗碱含量、干膏率的综合评价为指标，考察加水量、煎煮时间、煎煮次数对消痔洗剂指标成分含量的影响，优选出最佳提取工艺，以期为医院制剂的质量控制和制备工艺提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AE-240电子分析天平(上海赛多利斯科学仪器有限公司)；QCD3120超声波清洗器(天津旗美科技有限公司)；HN101-1A鼓风干燥箱(南通沪南科学仪器有限公司)；HH-S2数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司)。

1.2 材料 盐酸小檗碱(批号：110713-202015，中国食品药品鉴定研究院)。高效液相色谱所用试剂为色谱纯，水为去离子水，其他试剂为分析纯。所用中药饮片均购自南通市三越饮片有限公司，并由本院主任中药师鉴定。

2 方法与结果

2.1 鱼腥草挥发油的提取

2.1.1 浸泡时间与吸水率的考察 称取处方量药材2份，置于烧杯中，分别加入12倍量的水，用保鲜膜封住烧杯口，分别在室温下静置0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，并称量重量，每次分别倒出被药材吸收剩下的药液体积，计算吸水率[7]，最终确定药材的浸泡时间为2 h，药材吸水率为393%。

2.1.2 加水量的考察 取4份药材，分别加入10、12、14、16倍处方量水，浸泡2 h后，加热提取5 h，收集挥发油，计算挥发油提取率，确定加水量为14倍处方量。结果见表1。

表1 鱼腥草加水量的考察

2.1.3 提取时间的考察 取4份药材，分别加入14倍处方量水，浸泡2 h后，分别加热提取挥发油3、4、5、6 h，收集挥发油，计算鱼腥草挥发油提取率，确定提取时间为5 h。结果见表2。

表2 鱼腥草提取时间的考察

2.1.4 验证试验 对鱼腥草浸泡时间、加水量、提取时间进行考察，最终确定鱼腥草挥发油提取工艺，即加入14倍处方量的水，浸泡2 h，提取 5 h。按照确定最佳提取工艺，称取3份鱼腥草平行操作，结果表明此工艺合理可行，具有较好的稳定性。结果见表3。

表3 挥发油提取工艺的验证试验

2.2 水提取工艺优选

2.2.1 浸泡时间与吸水率的考察 称取处方量药材，置于烧杯中，分别加入7倍量的水，用保鲜膜封住烧杯口，分别在室温下静置0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，量取体积，称取重量，计算吸水率，最终确定浸泡时间为1.5 h，药材吸水率为156%。

2.2.2 溶液配制 对照品溶液：精密称取盐酸小檗碱10.26 mg，用流动相溶液定容于10 mL容量瓶，即得。

供试品溶液的制备：按处方量称取药材，加入8倍量的水，浸泡2 h，煎煮1 h后，精密吸取10 mL提取液，水浴蒸干后，用流动相定容10 mL容量瓶中，即得。

阴性供试品溶液的制备：按处方量称取除黄柏外的药材，按“供试品溶液”项下的方法制备，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Inertrustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加入十二烷基硫酸钠0.1 g)，柱温30 ℃，流速1 mL/min；对照品进样量5 μL，供试品进样量20 μL。

2.2.4 专属性 分别吸取对照品溶液、供试品溶液、缺黄柏的阴性供试品溶液，按色谱条件进样分析，阴性供试品溶液在对照品相应位置无吸收，表明盐酸小檗碱无阴性干扰。色谱图见图1。

图1 消痔洗剂中盐酸小檗碱的色谱图

2.2.5 线性关系考察 精密量取适量的对照品溶液，加入流动相进行稀释至123.39、105.76、83.76、70.51、52.88、32.25、17.63 μg/mL的浓度对照品溶液。分别吸取各浓度的对照品溶液 5 μL，注入高效液相色谱仪中测定。得到现性方程为y=2440.76x+44273，(r=0.999)，盐酸小檗碱在17.63～123.39 μg/mL间现性关系良好。

2.2.6 精密度实验 精密吸取同一对照品溶液，按色谱条件进样检测，重复测定6次，以峰面积计算，RSD为0.06%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性实验 取同一批样品，按“供试品溶液”制备方法平行制备6份，按色谱条件进样检测，测定盐酸小檗碱含量的RSD为0.91%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h分别进样，测定色谱峰面积，RSD为0.11%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.9 加样回收率 精密吸取已知含量的同一批供试品溶液共6份，加入适量盐酸小檗碱对照品溶液，按“供试品溶液”制备方法制备供试品溶液，测定盐酸小檗碱的含量，平均回收率为101.98%，RSD为1.59%(n=6)。

2.3 正交试验 试验根据临床用药方法，确定采用水提方法进行提取，影响水提主要因素为A加水量(倍)、B煎煮时间(h)、C煎煮次数(次)。采用L9(34)正交试验设计优选最佳提取工艺参数。因素与水平见表4，正交试验结果见表5，方差分析见表6。

表4 因素水平表

表5 正交试验设计及结果

续表5

表6 方差分析结果

分析表明，在中药水提过程中，煎煮时间为显著性影响因素(P<0.05)，可根据生产实际情况适当调整。因此本实验结果表明正交试验优选的最佳提取工艺为A3B2C2，即加12倍量的水，煎煮1.5 h，提取2次。

2.4 验证试验 称取与正交试验等量饮片3份，按优选的提取工艺提取，结果见表7，表明优化水提工艺提取率较高，工艺稳定。

表7 水提取工艺的验证试验

3 讨论

肛肠疾病的基本病因病机一般受风湿热燥等外邪的作用、情志内伤、饮食起居等因素的影响，湿热下注于大肠，经络阻滞，气血不畅，淤血浊气留滞肛门大肠而衍生诸多病症[8-9]。西医治疗多采用高锰酸钾等坐浴方式，但治疗效果并不理想[10]。消痔洗剂为如东县中医院肛肠科临床经验方，具有清热利湿解毒、散瘀止痛、去腐消肿等功效，临床上有消除痔疮炎症肿胀脱出、嵌顿、抗菌等作用，促进痔疮术后创面愈合作用，临床使用超过十年，临床研究[11-12]表明患者使用效果良好，值得应用推广，表明该制剂制备工艺可以深入开发。

采用单因素试验考察挥发油提取工艺时，曾考察鱼腥草、败酱草、鱼腥草和败酱草三组挥发油提取，在实验的1 h内可清晰看到鱼腥草黄色挥发油，而败酱草在实验的4 h后看到少量的聚集物显红色，且聚集物呈白色无定形粉末状漂浮于油面，败酱草的挥发性成分极其少。鱼腥草和败酱草共同提取得到棕红色的挥发油且油内夹杂着白色无定形粉末。实验采用的败酱草为黄花败酱草，现代研究[13]表明，黄花败酱草虽含挥发性成分，但未发现相关大量的研究败酱草中挥发油，且药理作用尚未清晰，加之黄花败酱草提取出难容于水油的白色粉末状物质[14]，为不影响后期的实验研究，本实验去除黄花败酱草的挥发性成分提取。最终确定鱼腥草挥发油提取工艺加入14倍量的水，浸泡2 h，提取5 h，该工艺合理可行。

黄柏为方中君药，具有泻火解毒，清热燥湿，除骨蒸、退虚热等功效，其化学成分主要有生物碱类、酚酸类、黄酮类、多糖类等，具有抗菌、抗炎、消肿、止痛等药理作用[15-16]。水提工艺考察过程中，根据处方分析，将君药黄柏中盐酸小檗碱、干膏率作为考察指标[17-18]，设计正交试验。参照文献[19-20]对色谱条件多次考察，最终确定色谱条件参照2020版《中国药典》一部黄柏项下含量测定[21]，实验表明该色谱条件分离度良好，阴性供试品对本法测定无干扰。最终确定水提工艺为加入12倍量的水，浸泡1.5 h，提取1.5 h，煎煮2次，该工艺稳定可行。

综上所述，消痔洗剂的提取工艺分两步提取。第一步考察鱼腥草挥发油提取工艺，由于鱼腥草挥发油抗菌抗炎活性较好[22-23]，增强消痔洗剂抗菌抗炎效果，将鱼腥草挥发油充分得到应用。第二步考察鱼腥草药渣、黄柏、虎杖、芒硝、败酱草等中药的提取工艺，采用水提工艺合理可行。结果表明消痔洗剂提取工艺合理稳定可行，后续开发将继续按照外用中药洗剂的要求，结合现代化技术对该洗剂进一步考察开发。