肾透明细胞癌组织和细胞系趋化素样因子1的表达及其临床意义

塔 拉， 宣成睿

(1.内蒙古自治区人民医院泌尿外科， 呼和浩特 010017； 2.内蒙古医科大学病理生理教研室， 呼和浩特 010059)

肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。2018年，国际癌症研究中心的数据显示：肾癌新发病例40.3万例，死亡17.5万例，分别居世界恶性肿瘤第14位和第16位[1]。在首次确诊为肾癌的患者中，约有50%的肾癌患者可以得到早期诊断，20%～35%患者在初诊时候已经发生远处转移。肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于肾实质中肾小管上皮的恶性肿瘤，是成年人中最常见的肾癌，占90%～95%[2]。肾癌包括10多种组织学和分子亚型，其中肾透明细胞癌(clear cell RCC，ccRCC)最常见[3]。目前早期局部肾癌的治疗以手术为主，但晚期肾癌患者的预后较差.越来越多的证据表明I期RCC患者的5年生存率为 80%～95%，而IV期 RCC患者的5年生存率急剧下降至10%以下，中位总生存期仅为10～15个月[4]。其主要原因是在治疗方法上，肾癌对放疗、化疗均不敏感。肾细胞癌的新兴疗法，包括激酶抑制剂和免疫疗法，正在改善患者的预后，也取得了这一进展，但仍有大量未满足的需求，因为只有少数患者实现对免疫治疗的完全反应[5-6]。截至目前，临床上尚无用于肾癌早期临床诊断的生物标志物投入使用。因此，探求肾癌的发病的分子机制、寻找肾透明细胞癌有效的诊断标志物，仍然是目前研究的热点、难点。

趋化因子是一类8～13 kDa 的小分子量蛋白质。参与许多生物过程，包括血管生成、肿瘤生长和转移以及白细胞的迁移。趋化因子可以调节免疫细胞运输和淋巴组织生长，从而调节抗肿瘤免疫反应[7-8]。对肾癌的研究显示：与正常组织相比12种趋化因子在肾癌组织中呈现差异性表达。CXC1/5/9/10/11/13的表达与RCC患者的病理分期存在显著相关性。CXCL1/2/3/5/13 转录水平低的 RCC 患者与更好的预后相关[9]。趋化因子中，过度表达促炎细胞因子CXCL7可加速裸鼠ccRCC 肿瘤的生长，是总生存率的独立预后因素[10]。趋化因子之间多具有20%～50%的同源性,即具有相同的基因序列和氨基酸序列。趋化素样因子1(chemokine-like factor 1, CKLF1)是由北京大学首次成功克隆的一个细胞因子。目前研究显示：CKLF1 对白细胞显示出广泛的趋化活性，并在炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用[11-14]。CKLF1还与多种恶性肿瘤的发生以及不良预后相关，是一种有效且非常有前景的治疗靶点[15]。肾透明细胞癌的发生与炎症、免疫调节关系密切，CKLF1在肾透明细胞癌的发生、发展中是否发挥作用，尚鲜见报道。为此，研究CKLF1在肾透明细胞癌组织及肾癌细胞系中表达水平并分析其临床意义，为肾透明细胞癌的临床诊断、预后的判断提供新的分子标志物。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

人肾透明细胞癌细胞系ACHN、Caki、肾小管上皮细胞HKC细胞株购自北京协和医学院基础学院。 MEM培养基、MaCoy’5A培养基、D/F12 DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司。CKLF1一抗、二抗购自Abcam公司。BCA蛋白质浓度检测试剂盒购自Solarbio科学技术有限公司。逆转录试剂盒和RT-PCR试剂盒购自Fermentas公司。

1.1.2 临床资料

选取2017—2018年在内蒙古自治区人民医院行手术切除的36例肾透明细胞癌患者标本及其对应的癌旁肾组织标本32例。所有入组患者均无免疫系统疾病，未患其他肿瘤，术前均未接受治疗。其中男19例，女17例，年龄在55～75 岁。临床病理Fuhrman分级：I级11例，II级21例，III级4例。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

ACHN细胞采用MEM培养基，Caki采用MaCoy’5A培养基,HKC采用D/F12 DMEM培养基，分别加入终浓度10%胎牛血清,置于细胞培养箱内常规培养。

1.2.2 免疫组化实验

肾癌组织、癌旁组织取材后，经4%多聚甲醛固定、脱水、透明、包埋、切片、烤片处理后，按照免疫组化试剂盒说明书步骤处理切片，进行检测。检测中以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。染色结果由两位副高以上的病理医师双盲读片得出。结果分析：在200倍显微镜下，随机选取视野5个/张，记录每个视野中阳性的细胞总数和细胞总数。阳性细胞的染色强度、阳性细胞所占的百分比判断标准如表1所示。两种积分相乘，对结果进行半定量判断。低表达为0～6分，高表达为7～12分。

表1 阳性细胞染色强度和阳性细胞占比的评分标准Table 1 The scoring standards of the staining intensity of positive cells and the percentage of positive cells

1.2.3 Western blot 检测CKLF1在细胞系ACHN，Caki、HKC中蛋白水平实验方法

当6孔板中的细胞融合度达到80%时，利用RIPA细胞裂解液裂解细胞，裂解后进行总蛋白提取。蛋白浓度采用BCA(bicinchoninic acid)法用酶标仪进行测量。常规十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉封闭。加入 CKLF1 一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜。洗膜后加入二抗(1∶10 000)，使用Odyssey LI-COR红外成像系统收集荧光信号。

1.2.4 Real-time PCR检测CKLF1在细胞系ACHN，Caki、HKC基因转录水平实验方法

提取待测细胞总RNA，按照试剂盒步骤进行逆转录实时定量PCR。反应体系 20 μL，定量PCR仪扩增反应条件设置：95 ℃变性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s，循环40次。GAPDH为内参，实验重复3次取平均值，记录循环域值Ct。采用ΔΔCt法对数据进行相对定量分析：公式改变倍数为2-ΔΔCt，ΔΔCt法=ΔCt(测试组)-ΔCt(正常细胞组)。引物序列如表2所示。

表2 CKLF1、GAPDH引物序列Table 2 CKLF1, GAPDH primer sequence

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0软件包进行数据的统计处理，各组计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。卡方检验方法分析免疫组化CKLF1在肾癌与癌旁组织以及细胞系中的表达差异；秩和检验Mann-Whitney U法分析CKLF1表达水平与临床病理Fuhrman分级之间的关系；蛋白及mRNA的表达,多组数据之间均数的比较采用单因素方差分析。如果方差分析结果具有显著性差异，组间方差齐则进一步采用最小显著差异法比较两两之间的差异，如果组间方差不齐，则采用DunnettT3法分析两两之间的差异；指标间相关性以Pearson相关系数来表示，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾透明细胞癌与癌旁组织中CKLF1的表达情况

CKLF1在肾透明细胞癌组织中的表达水平与癌旁组织相比，差异具有显著性 (P<0.05)，如表3、图1所示。肾透明细胞癌组织中，CKLF1高表达者免疫组化染色呈棕黄色，在癌旁正常组织中表达普遍偏低。依据临床病理Fuhrman分级：CKLF1表达水平的高低在临床病理各分级之间无明显差异(P>0.05)，如表4所示。

表3 CKLF1在组织中的表达情况Table 3 The expression of CKLF1 in tissues

图1 CKLF1蛋白在透明细胞肾细胞癌及癌旁 组织中的表达情况Fig.1 CKLF1 protein expression in clear cell renal cell carcinoma and adjacent tissues

表4 CKLF1表达水平与病理分级的关系Table 4 The relationship between CKLF1 expression level and pathological grade

2.2 CKLF1细胞系ACHN、Caki、HKC中的表达情况

细胞爬片处理后，免疫组化结果显示，CKLF1肾癌细胞系ACHN、Caki和肾小管上皮细胞HKC中均有表达，主要在胞浆着色，细胞膜亦有着色。CKLF1在ACHN和Caki中的表达与HKC不同，差异具有统计学意义(X2=8.182，P=0.017)，如图2所示。两两比较结果显示：与HKC细胞相比，Caki、ACHN中CKLF1的表达均明显高于HKC，差异均具有统计学意义 (P<0.05)。ACHN与Caki相比，Caki中CKLF1的表达明显高于ACHN，差异具有统计学意义X2=7.50，P=0.006)，且CKLF1在Caki细胞系中的表达量最高。

图2 CKLF1蛋白在肾癌细胞ACHN、Caki和 肾小管上皮细胞HKC中的表达Fig.2 Expression of CKLF1 protein in renal carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

2.3 CKLF1在细胞系ACHN、Caki、HKC的蛋白表达情况

Western blot检测结果显示，CKLF1肾癌细胞系ACHN、Caki的蛋白表达水平明显高于肾小管上皮细胞HKC如图3(a)所示。与HKC相比较，CKLF1蛋白相对表达量如图3(b)所示，差异有统计学意义(P<0.05)，如图3所示。

*表示与HKC组相比较P<0.05图3 CKLF1蛋白在肾癌细胞ACHN、Caki和 肾小管上皮细胞HKC中的表达Fig.3 Expression of CKLF1 protein in renal carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

2.4 CKLF1在细胞系中mRNA的表达水平

qRT-PCR结果显示，在mRNA水平，CKLF1在肾癌细胞系ACHN、Caki的水平显著高于肾小管上皮细胞HKC，差异有统计学意义(P<0.05)，如图4所示。

*表示与HKC组相比较P<0.05图4 肾细胞癌细胞株ACHN，Caki和肾小管上皮 细胞HKC中CKLF1 mRNA的表达量Fig.4 CKLF1 mRNA expression in renal cell carcinoma cell lines ACHN, Caki and renal tubular epithelial cells HKC

过去20年中，肾细胞癌的诊断和治疗有所改善，但RCC仍然是最致命的泌尿外科恶性肿瘤之一[16]，并且截至目前仍缺乏有效的针对肾癌的全身疗法[17]。肾癌发病机制极其复杂，目前尚未完全阐明。王永志等[18]在对肾透明细胞癌组织的研究发现：多种基因在肾透明细胞癌组织中表达出现失调，有的为上调，有的为下调，出现变化的基因主要参与免疫和炎症反应以及细胞迁移等生物学过程。细胞微环境的变化与肿瘤的发生、进展密切相关[19]。肿瘤微环境主要由炎性细胞和基质组成，炎性细胞分泌的小分子活性物质对于肿瘤细胞的生物学行为具有重要影响[20]，在此过程中发挥作用的信号小分子的主要是细胞因子和趋化因子。

趋化因子是能使细胞发生趋化运动的一类细胞因子, 其结构相似。绝大多数趋化因子含有 4个保守的半胱氨酸, 根据前两个半胱氨酸的相对位置不同, 趋化因子可分为 CXC(α)、CC(β)、C(δ)和 CX3C(γ)4个亚家族， C表示半胱氨酸, X表示任意氨基酸。趋化素样因子1具有CC家族趋化因子的基本功能和结构特征，即连续两个半胱氨酸的特征性结构和趋化功能[21]。CKLF1对单核细胞、淋巴细胞，参与炎性炎症反应的中性粒细胞，均具有明显的趋化作用[22]。在对小鼠肺炎的研究中观察到：CKLF1参与了在肺部和支气管的损伤与修复过程[23]，其作用机制是通过趋化并活化大量嗜中性粒细胞和免疫细胞而发挥作用。炎细胞活化后,释放出大量炎症介质，炎症介质可激活核转录因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB) 信号通路，激活的NF-κB又可与多种炎症因子基因启动子中的特异性κB序列结合，参与炎症因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)、趋化因子等基因转录，进而形成级联放大效应损伤机体[24]。而炎症细胞、免疫细胞的活化、聚集均与肾癌的发生密切相关[25-26]。各种研究显示CKLF1不仅参与炎症、免疫反应，在多种肿瘤发生、发展中也发挥着重要作用。趋化素样因子1表现出两大相反的作用: 一些肿瘤中CKLF1可能参与增强宿主抗肿瘤生长、浸润的固有或特异性免疫反应, 另一些肿瘤中，CKLF1则可能通过促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织中血管的生成, 从而促进肿瘤的生长和转移。在非小细胞肺癌组织中,CKLF1表达下调，它可能是重要的抑癌基因[27]。在肝癌组织中，CKLF1的高表达与血管浸润和不良生存相关,同时CKLF1可通过IL-6/STAT3信号通路抑制抑制肝癌细胞凋亡，促进肝癌的发生、转移。CKLF1可能成为肝癌潜在的分子治疗靶点[28]。熊英等[29]在对卵巢癌的研究结果显示：CKLF1在卵巢上皮性肿瘤中的表达水平增高，高表达的CKLF1可能与卵巢上皮性肿瘤的转移、不良预后相关。综上所述，同一趋化素样因子CKLF1在非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌中发挥了不同的生物学作用。研究结果显示：在肾透明癌组织中，CKLF1的表达水平明显高于癌旁正常组织，提示CKLF1在肾透明细胞癌的发生、发展过程中，可能发挥了重要的促进作用，其具体作用途径有待进一步实验验证。研究结果显示：CKLF1在肾透明细胞表达水平的高低，在临床病理Fuhrman各分级之间无明显差异，此结果提示CKLF1表达量与肾透明细胞癌的恶性程度关系不大，但同时也可能与本研究过程中，获取的样本量相对较少有关。此外，在对代表性肾癌细胞系的检测发现，CKLF1在肾细胞癌代表癌细胞系ACHN、Caki中，mRNA表达水平和蛋白的表达水平，均明显高于正常肾小管上皮细胞系HKC。

3 结论

通过对细胞因子CKLF1在肾透明细胞癌组织、癌旁组织、以及肾癌代表细胞系的表达情况的检测以及和病理分型之间的关系分析，得出以下结论。

(1)CKLF1在肾透明细胞癌组织中表达明显高于癌旁正常组织。CKLF1在肾透明细胞癌的发生、发展过程中可能扮演了重要促癌角色。CKLF1对肾癌发挥作用的具体信号通路，有待通过进一步实验研究验证。研究肾透明细胞癌的临床诊断及判断提供了新的依据,有望成为肾透明细胞癌新的临床诊断的生物学标志物，为肾癌的诊断和治疗提供了新的思路和方法。

(2)CKLF1在肾透明细胞癌代表细胞系ACHN、Caki中表达高于正常肾小管上皮细胞HKC。 而且在Caki细胞系中表达最高，Caki可作为CKLF1后续功能研究的代表细胞株。