TNF-α、IL-6、IL-17在胎膜早破母儿感染相关不良妊娠结局中的表达及临床价值

赵 倩，何 霞，凌 娅，可饶阳，李赛男，黄 蓉，祁文瑾

（昆明医科大学第一附属医院产科，云南 昆明 650032）

胎膜早破（premature rupture of membranes，PROM）是指在临产前胎膜发生自然破裂导致羊膜腔与外界相通，羊水持续渗漏。在PROM疾病进展过程中感染和炎症反应与胎膜破裂互为因果，一半以上的PROM患者中存在羊膜内炎症[1-2]。临床工作中PROM合并绒毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CS）早期症状及常用实验室指标变化不明显，一般是在出现产妇发热和母胎心动过速等临床体征时才引起关注，易延误诊断及最佳治疗时期。妊娠期多种生物途径导致子宫NK细胞活化和T细胞特异性亚群的发育，表现为妊娠期独特的免疫改变：调节性T细胞（Treg）数量增高，Th17数量减少，Th1细胞因子分泌减少，Th2细胞因子分泌增多。PROM发生时Th1/Th2、Th17/Treg细胞平衡打破，相关谱系的细胞因子表达改变[3-4]，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-17分别为Th1、Th2、Th17细胞的代表性细胞因子。本研究通过检测母血、脐血中TNF-α、IL-6、IL-17细胞因子在正常妊娠、PROM、PROM合并CS、PROM新生儿围产期感染孕妇中的水平变化，探讨以上细胞因子在PROM母儿感染相关并发症中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

选取2019年1月至2020年11月于昆明医科大学第一附属医院产科分娩的51例PROM孕妇为观察组，同期20例正常分娩孕妇为对照组。将观察组分为PROM无CS组（n=33）和PROM合并CS组（n=18）。观察组中10例PROM患者新生儿娩出后转至昆明医科大学第一附属医院NICU并确诊为新生儿感染者（新生儿败血症4例、新生儿肺炎3例、新生儿真菌感染1例、新生儿肠炎2例）归为A2组（n=10），其余PROM患者未发生新生儿围产期感染者归为A1组（n=41）。PROM及临床CS的诊断标准参照第九版《妇产科学》[5]，PROM诊断：临产前出现阴道流液或外阴湿润，窥阴器检查见羊水自宫颈口流出或后穹窿液池形成；阴道液测pH≥6.5；阴道液涂片见羊齿状结晶，出现上述任何一项可确诊PROM。临床CS诊断：（1）孕妇体温≥38.0 ℃；（2）阴道分泌物异味，羊水恶臭；（3）胎儿心率基线≥160次/分或母亲心率≥100 次/分；（4）孕妇外周血白细胞计数≥15×109/L；（5）子宫呈激惹状态，宫体有压痛。孕妇体温升高结合以上其他任何1项阳性体征可诊断为临床CS。产妇分娩后胎盘组织以HE染色法验证组织学CS[6]：绒毛膜、羊膜、脐带任一处组织中出现每高倍镜视野中有中性粒细胞浸润≥5个。新生儿围产期感染诊断标准参照第五版《实用新生儿学》（P510、P531、P582、P622）[7]。排除标准：本研究获得医院伦理委员会伦理批准，受试对象对此研究知情同意。2组孕妇均不伴任何孕前基础疾病及其他妊娠并发症，年龄在 20～35 岁，单胎妊娠，入院未临产，产检资料完整。利用Pass软件计算机模拟统计效率确定样本含量。

1.2 方法

1.2.1 标本的制备2组孕妇均在入院时（胎膜破裂12 h内）抽取肘静脉血3 mL、胎儿娩出后采集脐静脉血3 mL，将采集的血液标本分别装于普通无菌干燥试管中，4 ℃条件下待其自然凝固，于3 000 r/min离心20 min后留取血清于-80 ℃冰箱保存，集中测定母血及脐血血清TNF-α、IL-6、IL-17。研究对象胎盘组织以10%甲醛固定送检病理科。

1.2.2 主要试剂及检测方法人TNF-α、IL-6、IL-17定量ELISA试剂盒检测母血、脐血TNF-α、IL-6、IL-17表达水平（欣博盛科技生物有限公司）。胎盘组织石蜡包埋、HE染色后由高年资医生专人负责阅片检查组织学绒毛膜羊膜炎。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，符合非正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示；组间差异比较：计量资料满足正态分布的连续型变量2组间比较采用t检验，2组间比较采用方差分析；非正态分布2组间比较采用非参数Mann-Whitney检验，2组间比较采用非参数检验的Kruskal-Wallis H检验；计数资料组间比较采用卡方检验；母血脐血各因子之间表达的相关性采用Spearman相关性分析；采用MedCalc软件对单项指标直接绘制受试者工作特征（receiver 0perating characteristic，ROC）曲线，联合检测时先以Logistics回归计算出相关联合指标的回归方程及联合预测概率，再将联合预测概率绘制ROC曲线计算联合指标的诊断价值。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般情况

2组产妇年龄、孕次、孕前BMI值、孕期增重、入院体温、新生儿出生Apgar评分、新生儿脐动脉pH值差异均无统计学意义（P＞ 0.05），见表1。

表1 研究对象临床资料比较（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

表1 研究对象临床资料比较（）Tab.1 Comparation of clinical information between study objects（）

2.2 母血、脐血TNF-α、IL-6、IL-17在对照组、PROM无CS组与PROM合并CS组间表达水平比较

PROM合并CS组母血、脐血血清TNF-α、IL-6表达水平均高于PROM无CS组和对照组（P＜ 0.05）；PROM无CS组母血TNF-α、脐血IL-6的表达水平高于对照组（P＜ 0.05）；2组间母血、脐血IL-17无统计学差异（P＞ 0.05），见表2。

表2 对照组、PROM无CS组、PROM合并CS组母血、脐血各因子表达水平比较Tab.2 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，PROM without CS group and PROM with CS group

2.3 母血、脐血TNF-α、IL-6、IL-17的在对照组、A1组和A2组间表达水平比较

PROM组中未发生新生儿围产期感染者为A1组，PROM发生新生儿围产期感染者为A2组，A2组母血、脐血血清TNF-α、IL-6和IL-17表达水平均高于A1组和对照组（P＜ 0.05）；A1组母血TNF-α、脐血IL-6的表达水平高于对照组（P＜ 0.05）；见表3。

表3 对照组、A1、A2组母血、脐血各因子表达水平比较Tab.3 Comparation of various cytokine expression levels in maternal serum and umbilical cord serum between the control group，A1 group and A1 group

2.4 TNF-α、IL-6及IL-17的Spearman等级相关性分析

母血、脐血血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表达水平均呈显著正相关，见表4。

表4 各细胞因子在母血、脐血中的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of each cytokine in maternal serum with it in umbilical cord serum

2.5 各因子表达水平的ROC曲线分析

2.5.1 母血、脐血TNF-α、IL-6诊断PROM合并CS的ROC曲线分析比较各因子单项及联合检测诊断PROM合并CS的AUC可见：单项检测时，母血TNF-α的AUC最大（0.763），母血TNF-α的AUC高于脐 血TNF-α（0.614）（P＜0.05）；联合母血或脐血中TNF-α+IL-6两项指标诊断PROM合并CS的AUC与母血、脐血中单项指标检测相比无统计学差异（P＞ 0.05）；联合母血+脐血TNF-α+IL-6 4项指标诊断PROM合并CS的AUC（0.820）显著高于脐血TNF-α单项指标的AUC值（0.614）（P＜ 0.05），此外联合母血+脐血TNF-α+IL-6四项指标诊断PROM合并CS的AUC与其他单独或联合检测指标差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表5,图1。

图1 母血、脐血TNF-α、IL-6诊断PROM合并CS的ROC曲线Fig.1 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

表5 母血、脐血TNF-α、IL-6诊断PROM合并CS的ROC曲线Tab.5 ROC curve of TNF-α and IL-6 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

2.5.2 母血、脐血TNF-α、IL-6和IL-17预测PROM发生新生儿围产期感染的ROC曲线分析比较各因子单项及联合检测预测PROM发生新生儿围产期感染的AUC可见：单项检测时，母血中IL-6的AUC最大（0.800），脐血中IL-17的AUC最大（0.829），脐血IL-17的AUC高于母血IL-17（0.735）（P＜ 0.05）；联合母血、脐血中AUC较大两项单项指标（母血TNF-α+IL-6、脐血IL-6+IL-17），母血、脐血各三项指（TNF-α+IL-6+IL-17）以及母血+脐血TNF-α+IL-6+IL-17 6项指标诊断PROM发生新生儿围产期感染的AUC与母血、脐血中单项指标单独检测相比无统计学差异（P＞ 0.05）；但联合脐血IL-6+IL-17 2项指标以及联合脐血TNF-α+IL-6+IL-17 3项指标诊断PROM发生新生儿围产期感染的AUC较大（0.863、0.866），诊断效果较好，见表6,图2。

图2 母血、脐血TNF-α、IL-6和IL-17诊断PROM新生儿围产期感染的ROC曲线Fig.2 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with neonatal infection during perinatal

表6 母血、脐血TNF-α、IL-6和IL-17诊断PROM发生新生儿围产期感染的ROC曲线Tab.6 ROC curve of TNF-α，IL-6 and IL-17 in maternal serum and umbilical cord serum in the diagnosis of PROM with CS

3 讨论

TNF-α属于Th-1类细胞因子，是一种多向性的促炎细胞因子，胎盘处可由活化的CD4+T淋巴细胞、单核-巨噬细胞，NK 细胞及滋养细胞产生。PROM相关的凋亡途径可以通过TNF-α受体/fas或P53/Bax介导的途径发生[8-9]人类胎膜组织的体外研究证明[10-11]：TNF-α也许是能使基质金属蛋白（matrix metalloproteinases，MMPs）激活的最强介质，而MMPs可通过调节胎膜组织中细胞外基质蛋白代谢的方式促进细胞外基质胶原的降解，从而导致胎膜的破裂。

IL-6属于Th-2类细胞因子，也可由Th0细胞、妊娠滋养细胞释放，是gp130细胞因子家族中的一种多功能细胞因子，参与调节急性期反应、参与先天免疫转变为获得性免疫的过渡调节。羊水中IL-6的浓度被证明是羊膜内炎症的可靠生物标志物，足月绒毛膜性羊膜炎妇女羊水中的IL-6浓度与流式细胞术获得的总白细胞，嗜中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞的数量正相关[12]；同样，在未足月PROM患者中IL-6浓度也与羊水中的中性粒细胞或单核细胞/巨噬细胞数量显着正相关[13]。

Th17和Treg 细胞是两种在免疫反应中起重要作用的 CD4+T淋巴细胞亚型，可桥接适应性免疫反应和先天性免疫反应，其中Th17细胞能分泌IL-17参与炎症反应、细胞内和细胞外病原微生物感染免疫应答以及自身免疫性疾病等过程。体外研究[14]发现IL-17可通过激活活性氧/核因子kB（ROS/NF-κB）信号途径的方式诱导MMP-2/MMP-9的表达引发胎膜破裂。

本研究结果显示PROM合并CS组母血和脐血血清TNF-α、IL-6水平均显著高于PROM无CS组及对照组，PROM新生儿围产期感染者母血、脐血血清TNF-α、IL-6、IL-17 3者水平也均高于PROM无新生儿围产期感染组和对照组，PROM无母儿感染相关不良妊娠并发症者母血TNF-α、脐血IL-6水平均显著高于对照组。研究表明，当PROM合并感染时，细菌产物可促进MMPs的激活从而使胶原蛋白降解，细菌激活的天然免疫反应可使包括TNF-α、IL-6在内的促炎细胞因子、趋化因子等激活[15]，血清中单独升高的IL-17发挥的促炎效果不明显，但IL-17与其他促炎细胞因子如TNF-α，IL-1β，IL-22，干扰素-γ和粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子同时产生可引发血清IL-6和IL-8水平升高，促进大量活化中性粒细胞的募集到炎症部位，从而放大中性粒细胞的促炎反应[16]。

本研究母血、脐血TNF-α、IL-6、IL-17分别呈显著正相关，提示临床工作中，在分娩前若考虑到脐血标本采集的局限性仅检测母血TNFα、IL-6、IL-17可有效体现出脐血中的相关因子的水平，反应胎儿的炎症水平。而胎儿娩出后抽取脐静脉血检测以上指标也可先于病检一步辅助诊断CS和预测未来的新生儿围产期感染。

ROC曲线分析提示，在预测PROM母儿感染相关不良妊娠结局时母血TNF-α的预测价值优于脐血，脐血IL-17的预测价值优于母血；猜测TNF-α可能参与了PROM母体的感染及炎症反应，当感染及炎症进一步影响到胎儿并导致将来发生的新生儿围产期感染时即促发了胎儿IL-17的产生，IL-17又进一步促进TNF-α、IL-6的产生增多。这与Rito Daniel等[17]的研究相似：暴露于组织学绒毛膜羊膜炎的早产儿的Th17型免疫反应增强。本研究提示IL-17有望成为预测PROM新生儿围产期感染的新指标。同时发现，多项指标联合检测的临床价值较好，在临床工作中运用时可能具有较好的真实性和实用性。

TNF-α、IL-6可能参与了PROM母体感染的发生发展，对预测PROM合并CS具备一定的临床意义，而IL-17可能参与了胎儿宫内感染过程，当PROM患者TNF-α、IL-6、IL-173项指标同时升高时，须警惕严重的胎儿宫内感染，临床工作可尽快终止妊娠、加快产程、加强抗感染治疗、积极做好新生儿复苏准备以及儿科医生陪同分娩及早做好新生儿转科治疗准备。