氢气水调控自噬对百草枯中毒大鼠肺纤维化的影响

刘永骏 ，王 颖 ，杨 眉 ，殷娥高 ，李 婷 ，董昭兴

（1）昆明医科大学第二附属医院呼吸与危重症科一病区，云南 昆明 650101；2）云南师范大学校医院，云南 昆明 650101；3）中国科学院大学宁波华美医院，浙江 宁波 315000）

百草枯（paraquat，PQ）是一种全世界广泛使用的廉价、有效且对环境无害的非选择性除草剂，同时也是一种口服摄入致死率极高的毒药[1]。PQ摄入后通过多胺转运系统选择性的在肺组织中聚集，通过炎性细胞浸润、氧化应激、脂质过氧化等多种机制导致急性肺损伤和肺纤维化，最终导致患者死亡。尽管口服PQ中毒致死率超过90%，但目前尚无特效的治疗办法[2-3]。

肺纤维化是由多种原因导致的肺泡上皮细胞持续性损伤、肺泡异常修复以及细胞外基质沉积所导致[4]。自噬是机体维持细胞稳态的关键，研究发现自噬可以保护肺泡上皮细胞免受博莱霉素诱导的应激和凋亡，并调节炎症[5]，相反自噬不足可加速肺泡上皮细胞衰老，诱导成纤维细胞向肌成细胞分化，促进肺纤维化的形成[6]。

分子氢因其可以迅速扩散到组织和细胞中发挥出强大的抗氧化、抗炎、抗凋亡作用，已被广泛运用到多种疾病的治疗中[7]。最近有多项研究报道了分子氢可以通过调控自噬来发挥对疾病的治疗作用，但分子氢对自噬的调控作用尚无统一认识[8-11]。氢分子可以通过多种方式予以给药，包括吸入氢气、饮用氢气水，氢生理盐水腹腔注射等方式被广泛用于动物研究[12-13]。本课题组前期研究发现了氢气水可以通过调节Nrf2（nuclear factor-erythroid 2 related factor）发挥抗氧化作用从而减轻了肺纤维化[14]，但前期研究仅在体外实验中进行验证，暂无体内实验支持，并且对于氢气水治疗肺纤维化作用的机制研究尚不足。

本研究旨在通过观察氢气水作用于PQ中毒的肺纤维化大鼠模型中自噬的变化，进一步通过体内实验验证氢气水对于肺纤维化的治疗作用，并且解释氢气水治疗PQ所致肺纤维化的可能机制，为治疗PQ所致肺纤维化开辟新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

本试验采用6～8周的雄性SD大鼠50只，体重（230 ± 30）g，饲养于22～24 ℃环境中，自由饮食饮水，光照周期为12 h。本实验SD大鼠均由昆明动物研究所[许可证号：SCXK（滇）2016-0001]购买，经动物伦理审查通过后，适应性饲养1周。

主要试剂：百草枯（江苏省先正达南通保护有限公司）、雷帕霉素（美国 Sigma公司）、使用制氢设备将氢气在高压（0.4 Mpa）下溶解于0.9%的盐水中至饱和。4 ℃下灭菌保存于铝袋中以备用，每周重新制备1次，确保浓度保持在0.6 mmol/L。一抗LC3、p62抗体（美国Proteintech公司）、βactin内参抗体、鼠/兔二抗（中国万类生物公司）、PCR 引物（中国擎科生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物模型建立及分组（1）百草枯中毒大鼠模型建立方法：将SD大鼠颈部固定，暴露腹部，持灌胃针进入大鼠口腔，顺着上颚到达食管，沿食管垂直进针3～4 cm，确定灌胃针进入大鼠胃部后根据分组给予不同处理。灌胃操作完成后，密切观察大鼠有无呼吸困难、呕吐等症状。灌胃1 h后根据不同分组进行相应的药物处理，在模型建立第28天处死大鼠，取大鼠肺组织标本。由于百草枯毒性较大，死亡的大鼠需补齐至每组10只，处理方法同前。（2）将50只大鼠禁食10 h后，随机的分为5组，每组10只大鼠。对照组：予等体积蒸馏水一次性灌胃；PQ染毒组：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃；雷帕霉素治疗组：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射；氢气水治疗组：予百草枯50 mg/Kg一次性灌胃并予氢气水10 mL/（kg·d）腹腔注射；综合治疗组：予百草枯50 mg/kg一次性灌胃并予雷帕霉素4 mg/（kg·d）腹腔注射，间隔30 min后再次给予氢气水10 mL/（kg·d）腹腔注射。

1.2.2 苏木精-伊红染色（HE染色）评定肺纤维化程度取大鼠右肺组织标本，经4%多聚甲醛固定1周后，经脱水、包埋、切片制成石蜡切片；将石蜡切片置于载玻片上脱蜡、水化后，予苏木素染色30 s，流水冲洗5 min，伊红染色30 s，再次流水冲洗5 min，最后放入透明剂中浸泡10 min透明化后予中性树脂封片。光学显微镜下观察大鼠肺组织形态变化。

1.2.3 马松染色（Masson’s 染色）评定肺纤维化程度取大鼠右肺组织标本，经4%多聚甲醛固定1周后，经脱水、包埋、切片制成石蜡切片；将石蜡切片置于载玻片上脱蜡、水化后，予苏木素染色5 min，酸性乙醇分化液分化5 s，流水冲洗5 min，Masson蓝化液反蓝3 min，蒸馏水冲洗5 min，予丽春红品红染色5 min，磷钼酸溶液浸洗1 min，弱酸溶液浸洗1 min，苯胺蓝染色1 min，再次弱酸溶液洗1 min，最后无水酒精以及二甲苯脱水后予中性树脂封片。光学显微镜下观察大鼠肺组织形态变化。

1.2.4 RT-PCR 技术检测各组Col-I、Col-IImRNA的表达取大鼠右肺组织标本，加入1 mL Trizol充分研磨，冰上静置裂解5 min，加入200 μL氯仿混匀后静置5min。设置低温冷冻离心机温度为4 ℃，转速为12 000 r/min，离心15 min，取上清液，加入等体积异丙醇，混匀后静置15 min，再次使用低温冷冻离心机离心15 min，弃上清液，使用75%酒精洗涤沉淀2次，晾干，加入超纯水50 μL溶解获得RNA提取物。将得到的RNA提取物进行逆转录，获得相应的cDNA。将cDNA模版、上下游引物、2XTaqPCRMaster-mix混合后置于96孔板中，上机，设置反应程序95 ℃变性20 s，95 ℃变性1 s、60 ℃退火20 s，共循环40次。获取各样本中mRNA含量值，重复3次实验，取平均值。

引物序列如下：

Col-IF：5′ AAAACGGGAGGGCGAGTG 3′

R：5′ CCATAGGACATCTGGGAAGCAA 3′

Col-IIIF：5′CTGGTTTCTTCTCACCCTGCTT 3′

R：5′ TTTGACATGGTTCTGGCTTCC 3′

1.2.5 Western blot 法检测各组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达取大鼠右肺组织标本，加入500 μL Ripa充分研磨，冰上静置裂解5 min。设置低温冷冻离心机4 ℃ 12 000 r/min，离心15 min，取上清液。使用BSA法测定蛋白含量，将蛋白溶液混入缓冲液，沸水中煮15 min变性。根据蛋白含量，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上加样，电泳1 h，转PVDF膜1 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗放置4 ℃冰箱孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入二抗孵育1 h，再使用TBST洗膜3次后，予显影剂上机显影。使用ImageJ软件以内参蛋白 β-actin 的比值作为半定量比较的依据，测定膜上图像灰度值。

1.3 统计学处理

采用Graphpad Prism 5.0统计学软件进行分析，数据采用均数±标准差（）表示，计量资料符合正态分布，采用单因素方差分析，选取Tukey’s Multiple Comparison Test进行组间差异性分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色及Masson’s 染色结果

大鼠肺组织病理切片HE染色显示，PQ染毒组标本表现出肺泡结构大面积破坏，肺泡间隔明显增厚，炎性细胞大量浸润，形成斑片状纤维化病灶；雷帕霉素治疗组和氢气水治疗组也表现出了肺泡结构破坏，肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润，但较PQ组表现较轻；综合治疗组对比对照组标本的上皮细胞脱落和肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润表现更轻，程度介于对照组和氢气水治疗组或雷帕霉素治疗组之间，见图1A。

大鼠肺组织病理切片Masson’s 染色显示，PQ染毒组表现出肺泡结构完全丢失，大量胶原堆积在肺泡间隔中，胶原染色明显；氢气水治疗组和雷帕霉素治疗组胶原染色阳性率下降，肺泡结构丢失但较PQ染毒组轻；综合治疗组胶原染色阳性率显著下降，肺泡组织结构与氢气水治疗组或雷帕霉素治疗组相比更加完整，见图1B。

图1 肺组织染色结果（× 200）Fig.1 Lung tissue staining（× 200）

2.2 RT-PCR测定Col-I和Col-IIImRNA结果

PQ染毒组大鼠肺组织中的Col-ImRNA表达与对照组相比显著升高（P＜ 0.01），经氢气水治疗后Col-ImRNA表达下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治疗组和综合治疗组Col-I mRNA表达较氢气水治疗组更低（P＜ 0.01），且二者表达量，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见图2A。

PQ染毒组大鼠肺组织中Col-IIImRNA表达与对照组相比显著升高（P＜ 0.01），经氢气水治疗后Col-IIImRNA表达下降（P＜ 0.05），雷帕霉素治疗组较氢气水组Col-IIImRNA表达低（P＜ 0.05），但二者差异无统计学意义（P＞ 0.05），综合治疗组Col-IIImRNA表达最低（P＜ 0.01），见图2B。

图2 不同处理组Col-ImRNA和Col-IIImRNA的表达Fig.2 Expression of Col-I mRNA and Col-III mRNA in lung tissues in different groups

2.3 Westernblot测定LC3-I、LC3-II和p62结果

在Westernblot测定大鼠肺组织中P62表达时发现，与对照组相比，PQ染毒组中P62表达显著上升（P＜ 0.001），与PQ染毒组相比，氢气水治疗组P62表达下降（P＜ 0.05），雷帕霉素和综合治疗组P62表达较PQ染毒组显著下降（P＜ 0.01），且二者差异无统计学意义（P＞ 0.05），见图3A、图3B。

在Westernblot测定大鼠肺组织中LC3表达，通过计算LC3-II/LC3-I比值观察自噬流变化，结果显示与对照组相比，PQ染毒组LC3II/I比值降低（P＜ 0.05）；与PQ染毒组相比，氢气水治疗LC3II/I值上升（P＜ 0.05），雷帕霉素治疗组较PQ染毒组LC3II/I值上升（P＜ 0.01），综合治疗组LC3/II/I值较PQ染毒组显著上升（P＜ 0.001），见图3A、图3C。

图3 不同处理组P62的表达和LC3-II/LC3-I比值变化Fig.3 Expression of P62 and change of LC3-II/LC3-I ratio in different treatment groups

3 讨论

分子氢作为气体小分子，可以在组织和细胞中快速扩散发挥作用。在室温和大气压下，分子氢可以溶解于水中，形成氢气水，并且饮用氢气水与吸入氢气作用相当[7]。尽管目前氢气水治疗作用的研究着重于抗氧化和抗凋亡作用方面，但越来越多的研究报道了氢气水可以通过调控自噬对抗多种疾病进程，包括心肌缺血/再灌注损伤[9]、急性肾损伤[10]、急性肺损伤[15-16]等。PQ所致的肺纤维化中自噬被激活还是抑制，目前研究尚存争议，Yao等[17]的研究报道了对于16HBE细胞，低剂量的PQ可以激活自噬，而高剂量PQ却抑制了自噬；Gxu等[18]的研究报道了急性PQ中毒致死的肺纤维化患者的肺组织中纤维化区域的细胞自噬功能障碍，自噬在PQ诱导肺纤维化形成的过程中起到了重要作用。根据本实验，得到以下结论：（1）百草枯染毒诱导大鼠肺纤维化形成并抑制了自噬。本研究采用病理组织切片及RT-PCR检测胶原蛋白的转录水平来评判肺纤维化程度。根据百草枯染毒后大鼠肺组织出现了急性肺损伤及肺纤维化表现，检测Col-Ⅰ mRNA及Col-ⅢmRNA的表达水平上升，证明本实验中百草枯诱导大鼠肺纤维化形成。通过WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3，与对照组相比，PQ组的LC3II/I比值无统计学差异，但P62表达升高，考虑PQ所致肺纤维化中的自噬流发生障碍，自噬被抑制[19]。（2）雷帕霉素激活自噬并减轻了百草枯诱导的大鼠肺纤维化。使用雷帕霉素治疗后，观察PQ染毒组大鼠的肺组织病理切片，与PQ组相比，发现雷帕霉素治疗组大鼠的肺组织结构破坏减轻，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表达较PQ组下降，提示大鼠肺纤维化减轻。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ较PQ组上升，P62表达下降，提示自噬受到促进。结果还显示雷帕霉素促进自噬作用优于氢气水。（3）氢气水减轻了百草枯诱导的大鼠肺纤维化并促进了自噬。使用氢气水治疗后，观察PQ染毒组大鼠的肺组织病理切片，与PQ组相比，发现氢气水治疗组大鼠的肺组织结构破坏减轻，同时检测Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA表达下降，提示大鼠肺纤维化减轻，WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3，计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值较PQ组上升，P62表达下降，提示大鼠肺组织中自噬流增加，自噬功能障碍得到改善。（4）氢气水联合雷帕霉素治疗百草枯诱导的肺纤维化优于二者单用，将氢气水与雷帕霉素合用于治疗PQ所致大鼠肺纤维化后，肺组织结构破坏比单用雷帕霉素或氢气水治疗更轻，Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA表达较单用雷帕霉素或氢气水组更低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p62表达水平均反应出综合治疗组自噬水平高于雷帕霉素或氢气水单用治疗组。

以上实验验证了自噬与PQ所致肺纤维化存在密切关系，PQ所致肺纤维化中存在自噬功能的障碍；通过促进自噬，恢复自噬功能，可以减轻PQ所致大鼠的肺纤维化程度；氢气水可以促进自噬，部分恢复自噬功能，从而减轻PQ所致的肺纤维化，为肺纤维化的治疗提供了新的思路。

目前研究认为肺纤维化的发病机制复杂[20]，本实验仅用百草枯进行肺纤维化造模存在局限性，还需在其他因素诱导肺纤维化模型中加以印证。另外，大鼠肺纤维化模型中同一部位肺纤维化程度不一至，检测结果可能存在一定误差。最后，在既往研究显示氢气水可以通过多种途径调节自噬[8-11]，本实验中氢气水究竟通过何种机制调控自噬治疗肺纤维化尚不清楚，需后期研究进一步深入。