1 800 MHz射频电磁场暴露对大鼠海马GFAP、NCAM和GABA受体表达的影响

2021-10-20张盛庆宇吴锡南李志强武慧欣蒋玉融杨思佳木云珍

昆明医科大学学报 2021年9期

张盛庆宇，舒逍，吴锡南，李志强，武慧欣，张媛，蒋玉融，杨思佳，木云珍

（1）昆明医科大学公共卫生学院；2）研究生院；3）生物医学工程研究中心；4）基础医学院，云南昆明 650500）

射频电磁场（radiofrequency electromagnetic field，RF）是指频率在100 kHz～300 GHz的电磁场，主要由手机、基站等通讯设备产生[1]。相关研究报道，长期的射频电磁场暴露可能对生物体的神经系统、消化系统、血液系统、生殖系统等方面均有不同程度的影响[2]。机体大脑是对射频电磁场敏感的器官之一[3]，脑组织受到射频电磁场后，会出现学习和记忆功能的改变，这是射频电磁场生物学效应的重点研究领域之一。胶原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞中特异性的中间丝蛋白，随着生长发育过程发生变化，并在神经退行性病变过程中发生相应改变[4]。神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）是成人神经可塑性的主要贡献者，可能参与中枢神经系统损伤修复、神经发育以及与年龄相关的认知功能下降等过程[5-6]。γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）是中枢神经系统内重要的抑制性神经递质，许多研究都已经证实GABA与认知、学习记忆密切相关[7-8]。本研究通过观察SD大鼠暴露后的体重及其海马内的GFAP、NCAM和GABA受体的变化，评估射频电磁场对大鼠的生理发育指标和海马体的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组

14只7周龄SPF级SD大鼠，雄鼠体重均在250～270 g，雌鼠体重均在200～220 g，由上海斯莱克实验动物公司提供［动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005］。适应环境1周后，分为暴露组和对照组，每组7只。暴露组雌雄比例3∶4，对照组雌雄比例4∶3。每天暴露时间固定12 h（20:00～8:00），持续3周。

1.2 暴露装置

射频电磁场暴露装置如之前研究所描述[9]，由惠普公司生产的信号发生装置（8614A Signal Generator 0.8～2.4 GHz）连接1个放大器（SCD Amplificateur Lineaire 1.3～2.6 GHz Made France）产生频率1 800 MHz微波，功率密度为0.5 mW/cm2。

1.3 主要仪器与试剂

兔抗鼠GFAP多克隆抗体（武汉博士德公司），山羊抗兔SP免疫组化试剂盒和DAB染色剂（福州迈新公司），多聚甲醛、明胶等免疫组化实验常规试剂均为分析纯，8592C频谱分析仪（惠普，美国），Model7620微波辐射测试仪（Narda，美国），8614A信号发生装置、信号放大器（惠普，美国），TX-B8H WiFi 2 400 MHz 发射装置（深圳市特信电子有限公司，中国），CM1900冰冻切片机（德国莱卡公司），90i摄影生物显微镜（日本尼康公司），Image Pro Plus 6.0病理图像分析系统（美国 Media Cybernetics 公司）。

1.4 大鼠海马组织CA1区、CA3区、DG区GFAP表达的测定

1.4.1 取材大鼠用戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，解剖后经主动脉插管，用4%多聚甲醇溶液（pH=7.4）灌流固定，断头取脑，浸入装有多聚甲醇溶液的容器中，放在4 ℃冰箱中后固定

1.4.2 组织切片将固定好的脑组织块应用梯度蔗糖溶液脱水至脑组织沉底，随后将大鼠海马组织从脑组织中分离，再用冰冻切片机将海马组织沿长轴方向行20 μm厚的连续冠状切片，每个海马组织取20～30张切片，将切片放入0.01 ml/L磷酸盐缓冲液中孵育保存并尽快测定。

1.4.3 免疫组化染色使用免疫组化反应链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method，SP法）进行染色，按说明书操作。用PBS冲洗，加一抗（1∶4 000）4 ℃过夜。再次用PBS冲洗，二抗37 ℃ 2 h。常规脱水，透明，封片。

1.4.4 图像及分折每张切片分别在海马CA1区、CA3区、DG区随机选取2个视野摄片，每张切片拍摄6次。拍片时均使用研究级显微镜，预实验找到最佳拍摄条件后，所有标本均按此条件进行拍片。拍摄完成后用IPP6.0图像分析软件进行图片分析，测定GFAP、NCAM、GABA阳性染色平均光密度值（mean optical density，MOD），然后求6个视野所测MOD值的平均值，此平均值即为该区域的最终MOD值。

1.5 统计学处理

应用SPSS17.0录入数据进行分析，对数据进行正态性检验。如数据符合正态分布，采用独立样本t检验进行比较，数据采用均数±标准差（）表示，P＜ 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般结果

各组未发现老鼠出现死亡和其他异常情况，外观正常。各组体重指标经统计分析，差异无统计学意义（p＞ 0.05），2组大鼠的体重无明显不同，见表1。

表1 大鼠一般情况分析（）Tab.1 General situation analysis of rat（）

2.2 GFAP在大鼠海马各区的表达

GAFP在大鼠海马CA1区、CA3区和DG区均有表达，阳性免疫组化染色结果呈褐色或棕褐色，形似蜘蛛，见图1。

图1 GFAP在大鼠海马各区的表达（SP法染色，×400）Fig.1 Expression of GFAP in rat hippocampus（SP，×400）

2.2.1 GFAP在大鼠海马各区MOD结果比较海马各区GFAP经统计分析，与对照组相比，CA1区、DG区差异有统计学意义（P＜ 0.05），CA3区无统计学意义（P＞ 0.05）。经射频电磁辐射21 d，暴露组大鼠海马CA1区、DG区GFAP的表达下降，见表2。

表2 大鼠海马不同区域的GFAP表达MOD值（）Tab.2 MOD value of GFAP expression in different regions of rat hippocampus（）

与对照组相比，*P ＜ 0.05。

2.3 NCAM在大鼠海马各区的表达

NCAM受体在海马CA1区、CA3区及DG区均有表达，阳性表达免疫组化呈棕色或棕褐色，形状为颗粒状，见图2。

2.3.1 NCAM免疫组织MOD结果比较NCAM表达的海马各区MOD值经统计分析分析，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。经射频电磁辐射21 d，暴露组大鼠海马各区NCAM的表达无改变，见表3。

表3 大鼠海马不同区域的NCAM表达MOD值（）Tab.3 MOD value of NCAM expression in different regions of rat hippocampus（）

2.4 GABA在海马各区的表达

GABA 受体在海马CA1区、CA3区及DG区均有表达，阳性表达免疫组化呈棕色或棕褐色，形状为颗粒状，见图3。

图3 GABA在大鼠海马各区表达（免疫组化SP法染色，×400）Fig.3 The expression of GABA in rat hippocampus（SP，×400）

2.4.1 GABA免疫组织MOD值比较结果GABA表达的海马各区MOD值经统计分析结果如下，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。经射频电磁辐射21 d，暴露组大鼠海马各区NCAM的表达无改变，见表4。

表4 大鼠海马不同区域的GABA表达MOD值（）Tab.4 MOD value of GABA expression in different regions of rat hippocampus（）

3 讨论

本次实验选择的GFAP、NCAM、GABA受体变化可反应RF-EMF对脑部的损伤程度暴露条件，模拟人群所处的1 800 MHz射频电磁场环境，进行全身暴露。经过3周，12 h/d的暴露后，2组大鼠的形态学未发现改变，大鼠海马CA1区、DG区GFAP的表达下降。

海马体是哺乳动物中枢神经系统的重要组成部分，是学习记忆功能的结构基础[10-14]。Maskey等[15]将大鼠暴露于835 MHz射频电磁场中，暴露1个月后，海马CA1区神经变性。在Altum等[16]的报告中，在射频电磁场暴露15 d，海马CA1区和CA2区神经元明显减少，而CA3区无明显差异。有报道，每天通过手机产生的900 MHz射频电磁场，动物暴露此环境15 d后，在海马CA1、CA3和齿状回亚区出现神经变性[17]。由此，笔者推测射频电磁场可能海马的CA1、CA3和DG区有所影响。

星形胶质细胞能够调节脑内的离子和神经递质的稳态，具有代谢功能，并在脑损伤时做出反应[18]。GFAP与阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）、抑郁症、中风和脑缺血等脑部疾病有关[19-21]。相关研究发现，将大鼠暴露于高强度射频电磁场后发现，脑内GFAP含量增加并对记忆功能有所影响[22]。国内研究发现，将50只雄性大鼠暴露在高功率的射频电磁场后发现，大鼠的学习记忆明显降低，星形胶质细胞中的GFAP含量增加[23]。因此，GFAP含量的增多可能会导致学习和记忆功能下降。NCAM与胶质细胞瘤、一氧化碳中毒后迟发性脑病和痴呆等疾病有关[24-26]，同时也参与了学习记忆的过程。研究发现，1 800 MHz电磁波，度值为0.5 m W/cm2的暴露下可致出生后SD大鼠海马NCAM表达下调，并且NCAM的下调可能是低剂量电磁波影响学习记忆的原因之一[27-28]。γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极重要的功能，与认知功能存在一定的关系。早期便有研究者证明了在一定条件的电磁辐射暴露下，GABA受体表达较对照组增高进而可能影响人的神经行为[29]。另外，在强度为2 450 MHz，功率密度为为5.0、10.0 mW/cm2的条件下，研究者发现昆明小鼠的GABA含量增高，学习记忆损伤逐渐加重[30]。在其他领域也证实，低功率密度微波辐射可以通过增加GABA、降低谷氨酸对小鼠的学习记忆产生损害[31]。

本研究结果表明，大鼠暴露于射频电磁场21 d后，大鼠海马CA1区、DG区GFAP的表达下降。根据相关的研究，笔者认为，在本实验条件下，1 800 MHz射频电磁场暴露可对海马CA1和DG区的GFAP表达有影响，本实验只进行了初步探索，在同样条件是否对海马CA1区、CA3区以及DG区的GFAP、NCAM和GABA受体表达产生影响，还需要进一步的研究。