茶-山苍子间作对茶园土壤微生物群落结构的影响

郝海平，白红彤，夏菲，郝渊鹏，李慧，崔洪霞，谢晓明，石雷✉

1中国科学院植物研究所/北方资源植物重点实验室，北京100093；2廊坊师范学院生命科学学院，河北廊坊 065000；3江西虔心小镇生态农业有限责任公司，中国科学院植物研究所虔心小镇试验基地，江西龙南 341708

0 引言

【研究意义】土壤微生物是茶园土壤生态系统的重要组成部分和最为活跃的生物因子，直接参与凋落物分解、养分循环及吸收等土壤生态过程，对茶树的健康生长、茶叶品质，以及维持土壤生态系统功能稳定具有重要的影响[1-3]。芳香植物是茶园有害生物综合治理（intergraded pest management，IPM）中重要的生物防治植物，是利用“Push-Pull”策略控制害虫的典型间作材料，近年来，应用芳香植物间作模式进行茶园病虫害生物防治逐渐普及[4]。因此，研究土壤微生物对茶-山苍子间作模式的响应，辨别土壤微生物群落结构变化及其影响，对茶-芳香植物间作模式生态效应综合评判和合理应用具有重要的理论和实践意义。【前人研究进展】土壤微生物种群结构极其脆弱，受多种因素影响，如栽培模式、农药和抗生素残留、植物种类等[5-9]。朱庆松等[10]研究表明信阳毛尖茶园覆盖稻草和白三叶显著增加土壤微生物量、C、N和P含量。杨清平等[11]研究不同生态茶园土壤微生物数量与活性发现，松–茶–鸡茶园土壤好气性固氮菌、好气性纤维素分解菌等比栗–茶生态茶园分别提高 2.8倍和1.6倍，比纯茶园提高8.7倍和5.0倍。徐晨光等[12]研究表明添加100 mg·kg-1青霉素至茶园土壤中，茶园土壤细菌数量减少80%；王慧敏[13]研究表明，茶园间作芳香植物藿香、鼠尾草等提高了6月份和10月份的0—30 cm土层土壤微生物数量。CHEN等[14]研究同样表明，果树与芳香植物罗勒、薄荷间作，对于土壤氮循环细菌种群数量有显著影响。芳香植物的显著特点是合成和分泌大量的具有驱虫和杀菌双重功效的次生代谢产物。如山苍子、迷迭香精油对茶叶害虫茶假眼小绿叶蝉及致病菌金色葡萄球菌、枯草杆菌等均具有较强的驱避和抑制作用[15-17]。【本研究切入点】尽管前人已经证明，间作芳香植物可以改变土壤微生物数量，但是土壤浸提液中具有杀菌和抑菌功能性成分如香茅醇、桉叶油醇与土壤微生物中致病、营养元素分解代谢等功能种群变化，以及土壤微生物种群结构改变与茶园土壤矿质营养元素相互关系方面还有待系统和深入研究。【拟解决的关键问题】本研究以茶-山苍子间作系统为基础，围绕土壤浸提液成分和土壤矿质营养元素，探讨间作系统中土壤微生物群落结构变化规律及其影响因素。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验地点位于江西省赣州市龙南县临塘乡东坑村虔心小镇生态茶园基地（114°78′ E，24°92′ N），海拔600 m，红壤，pH 5.3。亚热带季风气候区，年平均温度18.9℃，年平均降雨量1 526.3 mm。

试验地为竹林地开垦茶园，茶树品种为‘白叶 1号’，与山苍子间作时间约5年。试验地为有机茶园，秋施基肥（鸡粪、羊粪、豆饼肥）3 000—6 000 kg·hm-2，春茶后追施复合肥（N﹕P﹕K=15﹕15﹕15）150—225 kg·hm-2。茶叶每年分春茶和秋茶两次采摘。2018年春茶采摘完成后对茶树进行轻修剪，60 d后进行试验采样和数据测定。

本试验的间作材料为山苍子[Litsea cubeba (Lour.)Pers.]，是当地乡土芳香植物，茶园偶有分布，多年观测发现其对茶假眼小绿叶蝉具有显著的驱避效应，是潜在的具有较高经济价值和生物防治功能的茶园间作树种。

1.2 试验设计和取样方法

间作试验设计

处理组：以山苍子树干为圆心，以 0.5 m范围内的茶树和土壤为研究对象；对照组：选择 500 m范围内无山苍子间作区域作为对照区。具体设计如表1：

表1 茶-山苍子间作试验设计表Table 1 List of controls and experimental treatments

1.3 试验指标测定

土壤浸提液测定方法：采用乙酸乙酯浸提土壤，采用气-质联用（GC-MS）分析方法对其成分进行测定[18]。

取风干土样2 000 g，分批置于有盖玻璃瓶中，依次编号，按1:3体积比加入80%的乙酸乙酯溶液，将玻璃瓶放入振荡培养箱，20℃，200 r/min，恒温浸提24 h。按样品编号依次完全转入50 mL离心管中，5 000 r/min，离心15 min，过滤，取上清液，真空旋转蒸发仪将上清液浓缩至 1—1.5 mL，浓缩条件温度40—45℃，压强300 hPa，浓缩液用无水硫酸脱水，转移至安剖瓶保存，浓缩液即为土壤浸提液。

采用气-质联用（GC-MS）Agilent-6890 N/59731方法对浸提液进行分析，整体进样，体积为1.0 μL。色谱条件：色谱柱为Agilent 122—3 832（30 m×0.25 mm×0.25 μm），色谱柱在70℃条件下，保持2 min，然后梯度升温至 280℃，保持 20 min，升温频率 10℃·min-1，气化室气体为99.999%纯度He气，温度为250℃，气流量1.0 mL·min-1。质谱条件：EI源；电子能量70 eV，温度230℃；扫描速度0. 2 s，扫描范围（m/z）35—500 amu；溶剂延迟时间3.0 min。应用标准质谱谱库对所得数据进行比对，浸提液各组分含量采用面积法进行计算。

微生物（细菌和真菌）多样性测定方法：细菌采用16S rDNA，真菌采用ITS序列分析方法，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测定。

16S rDNA的PCR扩增：引物为515F 5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′和 907R 5′-GTGCCAGC MGCCGCGG-3′[15]。PCR 的 20 μL 混合反应体系包括4 μL 5×FastPfu Buffer，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1的上、下游引物各 0.8 μL，0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA和10 ng的样本DNA。

ITS序列的PCR扩增：引物为ITS1F（5′-barcode-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和 ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[15]。PCR 的 20 μL混合反应体系包括 4 μL的 10×Buffer，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，5 μmol·L-1上、下游引物各 0.8 μL，0.2 μL的rTaq Polymerase，10 ng的样本DNA。

PCR反应仪器及参数：PCR仪：ABI GeneAmp®9700型。反应参数为： 95℃ 3 min；循环数×（95℃ 30 s；退火温度 30 s；72℃ 45 s）；72℃ 10 min，10℃ until halted by user。

测序数据处理：将从Illumina MiSeq/HiSeq测序平台得到的初始数据（Raw Data），根据Barcode序列拆分为不同样品数据，并且截去PCR扩增引物序列和 Barcode序列。将拆分完成的数据应用 FLASH（V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）对每个样品的reads进行拼接，拼接序列为原始Tags数据；将原始Tags从连续低质量值（默认质量阈值为≤3）碱基数达到设定长度（默认长度值为 3）的第一个低质量碱基位点截断，然后进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags，然后与数据库（Gold database，http://drive5.com/uchime/uchime_download.html）进行比对（UCHIME Algorithm，http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.ht ml）检测嵌合体序列，去除嵌合体序列得到最终的有效数据。

OTU及物种群落分析：

（1）OTU聚类：应用Uparse软件（Uparse v7.0.1001）对所有样品的有效数据（effective tags）序列进行97%和95%的一致性聚类形成OTU；

（2）OTU注释：选取OTU代表序列应用RDPClassifier方法，与GreenGene、RDP（16S）、Unite（ITS）数据库进行比对获得物种注释信息；

（3）无效 OTU去除：去除嵌合体序列和测序错误序列；

（4）物种丰度统计：使用R软件进行OTU各个分类等级的注释比例和各个分类等级物种相对丰度的统计。

Alpha Diversity分析：稀释曲线：将OTU数据进行抽平处理，使用QIIME软件中的alpha_rarefaction.py程序进行稀释曲线数据计算及构图。

Beta Diversity指数统计：无度量多维标定法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS），将OTU数据进行抽平处理，使用QIIME软件计算beta多样性距离矩阵，R语言vegan软件包作NMDS分析和作图。

微生物功能预测：基于上海美吉生物医药科技有限公司云平台，细菌采用 Tax4Fun软件；真菌采用FUNGuild软件进行分析。

土壤矿质营养元素测定方法：称取过60目筛风干土样0.1 g，置于PTEE内胆中，顺序加入氢氟酸1.5 mL，硝酸0.5 mL，扣合内胆，编号，置于配套钢套内，150℃热反应8 h，冷却，取出内胆，150℃电热板蒸发驱酸，剩余溶液约1 mL时，加入1 mL硝酸，1 mL双蒸水，150℃回溶3 h，冷却后转移到40 mL聚乙烯瓶中，定容至40 mL，待测[19]。采用电感耦合等离子质谱（ICP-MS）仪测定 P、Mn、Cu、Zn、Fe、Mg离子含量。

1.4 数据分析

茶生长发育数据、微生物种群相对丰度、离子含量和土壤浸提液用 SPSS 16.0软件进行 One-Way-ANOVA单因素方差分析；微生物和环境因子的冗余分析（RDA），采用Canoco 5软件、Standard Analyses的Constrained程序进行，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 间作对茶园土壤微生物性质的影响

2.1.1 16S rDNA和ITS序列测序深度分析 山苍子间作处理与对照细菌和真菌样品稀释曲线均趋于平缓，表明测序趋于饱和，测序数据量渐进合理，能够相对真实地反映出土壤样品中细菌和真菌的群落组成，取样基本合理（图1）。

2.1.2 土壤微生物的OTU数、Chao1和Shannon 指数变化 土壤细菌（图 2-A、B、C），间作处理的OTU数、Chao1和Shannon指数显著高于对照，差异显著。CK.1和CK.2的OTU数分别为716、842；Lit.1和Lit.2分别为1 342、1 331，分别增加了87.4%和58.07%。Chao1和Shannon指数呈现与OTU数一致的变化规律，表明间作处理改变了土壤微生物种群和数量。

土壤真菌（图2-D、E、F），OTU数、Chao1和Shannon指数变化规律与细菌类似，均表现为间作处理真菌种群评价指数显著高于对照。CK.1和CK.2的OTU数分别为420、363，Lit.1和Lit.2分别为648、664，分别比对照增加了54.28%和82.92%。Chao1和Shannon指数变化趋势与OTU数相似。

2.1.3 土壤微生物的NMDS分析 NMDS数据分析显示，对照与山苍子间作处理的微生物群落聚集于图中不同区域，表明二者之间细菌、真菌种群类别存在显著差异；对照和间作处理内不同土层深度细菌、真菌虽然丰度存在一定差异，但是种类基本一致（图3）。

2.1.4 土壤微生物群落组成 山苍子间作处理显著改变了土壤细菌的群落组成。酸杆菌门、绿弯菌门、放线菌门群落结构变化显著；变形菌门、芽单胞菌门、疣微菌门、GAL15、浮霉菌门、硝化螺旋菌门种群丰度变化较小。CK.1和CK.2的酸杆菌门种群丰度分别为16.45%、16.97%，Lit.1和Lit.2分别为33.08%、37.44%。放线菌门变化趋势相反，Lit.1和Lit.2分别比CK.1和CK.2降低了54.76%和72.28%；绿弯菌门种群丰度分别降低了41.50%（Lit.1）、30.87%（Lit.2）（图4）。

子囊菌门、接合菌门、担子菌门、隐真菌门占整个菌群比例高，是主要真菌门类；其他真菌门类占整个菌群比例低，山苍子间作出现了大量的未知真菌。间作处理显著影响了子囊菌门和担子菌门群落结构，Lit.2子囊菌门种群丰度为53.79%，CK.2为40.64%；山苍子间作处理降低了担子菌门种群丰度比例，Lit.1和Lit.2比CK.1和CK.2分别降低了81.86%和54.72%。在未鉴定真菌门类中，Lit.1和 Lit.2种群丰度分别为21.86%、17.95%，CK.1和CK.2分别为3.32%、9.82%（图4）。

2.1.5 土壤微生物的潜在功能 针对丰度变化明显的细菌种群进行功能分析，种群功能主要涉及植物病原菌，磷、锰营养元素代谢转化，氮固定和代谢（表2）。山苍子间作显著影响了植物病原菌–黄单胞杆菌的丰度，CK.1和CK.2分别为218、493，Lit.1和Lit.2没有检测到黄单胞杆菌。具有溶解磷功能的伯克氏菌变化趋势与黄单胞杆菌相反，Lit.1和 Lit.2的丰度分别比CK.1和CK.2增加62倍和86倍。具有锰氧化功能的土微菌变化趋势与伯克氏菌相似，间作处理丰度比对照显著升高（表2）。与氮固定代谢相关的真杆菌和栖热菌丰度均呈现山苍子间作处理高于对照的趋势。如慢生根瘤菌Lit.1和Lit.2分别比CK.1和CK.2高146.09%和22.00%。

表2 微生物功能列表Table 2 List of microbe’s functions

子囊菌门真菌功能分析表明，丰度变化明显的真菌主要涉及致病、生物防治和纤维素降解。山苍子间作处理显著降低了致病真菌镰刀菌和山野壳菌的种群丰度（表 2）。CK.1和CK.2的丰度分别为4 729、3 122，Lit.1和 Lit.2为 695和 839，分别降低了 85.30%、73.13%；山野壳菌与镰刀菌变化趋势相似（表 2）。间作处理中，具有生物防治功能的拟康宁木霉种群丰度显著增加，与CK.1相比，Lit.1的OTU数增加38.75倍，Lit.2比CK.2丰度增加239.37倍；毛壳菌变化趋势与拟康宁木霉菌相似（表2）。

2.2 间作对茶园土壤浸提液影响

山苍子间作区域土壤浸提液，共鉴定出苯乙烯、樟脑、Alpha-松油醇、香茅醇、邻苯二甲酸二异丁酯、油酸酰胺等14种物质（表3）。峰面积占比大于5%的挥发物有6种，总占比为76.59%。6种挥发物中油酸酰胺峰面积占比最大，为28.57%；其次是樟脑和香茅醇，占比分别为12.80%和12.65%。Alpha-松油醇、邻苯二甲酸二正丁酯峰面积占比 6%—7%。峰面积占比大于 2%的挥发物为苯乙烯、桉叶油醇、乙酸冰片酯、乙酸香茅酯、邻苯二甲酸二异丁酯和棕榈酰胺。山苍子间作区域土壤浸提液含量最低的为2-甲基十七烷，占比为1.33%。

表3 山苍子处理土壤提取物成分分析Tabble 3 Soil extract of Litsea cubeba intercropping treatment

2.3 间作对茶园土壤矿质营养元素影响

间作处理显著影响土壤中的 P、Mn、Zn、Fe、Mg和Cu等元素含量。表层土壤中，CK.1的P元素含量 579.4 mg·kg-1，Lit.1 的含量为 932.8 mg·kg-1，间作处理比对照增加了 60.90%；根系分布层土壤中，Lit.2的P含量比CK.2增加了76.42%，差异显著（图5）。Mn元素的整体变化趋势与P元素类似（图5），Lit.1和Lit.2的Mn元素含量分别比CK.1和CK.2显著增加198.74%和169.28%（P<0.05）；Zn、Cu、Fe、Mg元素呈现出与P和Mn类似的变化趋势。

2.4 土壤微生物和环境因子冗余分析

土壤提取液和P元素位于第一和第四象限，表明二者与微生物群落结构变化呈正相关关系（图 6、表 4），环境因子箭头距原点距离较长，代表其与微生物群落变化间有较强的相关性。冗余分析结果显示，土壤提取液是影响土壤微生物群落组成的主要环境因子，总体关联度约 48%，差异显著（P<0.05）；土壤提取液中的桉叶油醇（Ci）、Alpha-松油醇（Alp）、苯乙烯（Ph）、樟脑（Bo）和香茅醇是影响土壤微生物群落组成的主要成分（图6、表4）。

土壤矿质营养元素中仅P元素对土壤微生物种群结构影响显著（P<0.05）。Fe、Zn、Mg、Mn和 Cu元素对土壤微生物群落结构无显著影响（图6、表4）。

表4 土壤微生物和环境因子冗余分析Table 4 Redundancy analysis of soil microorganisms and environment factors

3 讨论

土壤细菌和真菌是主要的土壤微生物类群，对土壤有机质分解、营养元素形态转换以及土传病害防治均具有重要作用。茶园优势的细菌门类有酸杆菌门、绿弯菌门、放线菌门、变形菌门、浮霉菌门；真菌门类有子囊菌门、接合菌门、担子菌门、隐真菌门，间作没有显著改变茶园土壤微生物优势门类（图 4），这与前人研究结果相似[20]。但是，茶-山苍子间作增加了土壤微生物群落总数，丰富了群落多样性，间作土壤中细菌和真菌的OTU数、Chao1和Shannon指数均显著高于对照（图 2），变化较大的门类是酸杆菌门和子囊菌门（图4）。杨清平等[11]研究发现栗–茶生态茶园土壤微生物数量、活性显著高于纯茶园；茶园间作芳香植物藿香、鼠尾草0—30 cm土层土壤微生物数量显著高于纯茶园[13]。间作改变茶园土壤微生物群落结构和丰度可能与土壤营养改善，茶园的植物种类增加，凋落物和根系分泌物增多有关。山苍子间作处理显著影响土壤 Mn、Cu、Fe等矿质营养元素，尤其间作处理的土壤磷元素比对照升高60.9%（图5），具有溶解磷、锰氧化和氮元素循环功能细菌，如 Lit.1中固氮菌比CK.1增加了146.09%（表2）。也有研究[21-22]发现茶园红壤的 CY06系列菌株影响土壤磷的溶解性。土壤增施N、P和K营养，土壤微生物种群丰度显著提高[23-26]。因此，土壤中营养元素含量增加，尤其是 P，可能跟土壤微生物种群结构改变和丰度增加有关。冗余分析印证了这一推断，土壤矿质营养元素P、Fe、Mn、Zn等与土壤微生物群落丰度具有一定的相关性，尤其是 P，达到显著相关。磷是间作改变土壤微生物群结构的主要土壤营养因子。

茶园间作，植物凋落物分解与根系分泌所产生的次生代谢产物，也显著影响土壤微生物的群落组成，影响方式和强度因植物而异。高寒草甸、烟草、葡萄等植物研究发现，不同植物类群覆盖下的土壤微生物种群结构和丰度因植物根系分泌物不同而差异显著[27-30]。本研究观测到山苍子间作处理的植物病原真菌镰刀菌、山野壳菌和植物病原细菌黄单胞杆菌种群丰度显著降低，如表土层和根系分布层的镰刀菌，山苍子间作处理种群丰度与对照相比分别降低了 85.3%和73.13%，而具有苯降解功能的黄色菌种群丰度则显著增加。这可能跟山苍子次生代谢类物质进入土壤有关。茶-山苍子间作区域土壤浸提液中樟脑、Alpha-松油醇和香茅醇具有抑菌和杀菌功能，酰胺类物质、邻苯类物质占比也较大（表 3）。前人研究已经证明香茅醇对茶茎点霉属病原菌具有拟制和杀灭作用[31-32]；Alpha-松油醇对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和大肠杆菌等具有一定的杀灭和抑制作用[33]。因此，土壤中植物病原微生物可能因樟脑、香茅醇等杀菌物质存在而减少，苯降解功能菌与含苯环类物质含量高相关。冗余分析显示，土壤浸提液即山苍子通过淋溶、分解或根系分泌进入土壤的次生代谢产物如Alpha-松油醇、香茅醇、樟脑、桉叶油醇等显著影响土壤微生物群落结构和丰度。茶-山苍子间作，土壤浸提液中的杀菌成分是间作影响土壤微生物群落结构的重要生态因子。

4 结论

茶-山苍子间作改变了土壤微生物群落结构和丰度，增加了土壤矿质营养转化吸收的功能性种群，降低了植物致病真菌和细菌数量，樟脑、Alpha-松油醇和香茅醇等次生代谢产物和P元素是土壤微生物群落变化的主要环境因子。茶园及其他农田系统间作植物的选择应重视间作植物次生代谢产物的输入，尤其是其中具有杀灭或抑菌功能的成分。