玉米赤霉烯酮吸附剂对后备母猪子宫中LC3、PCNA分布和表达的影响

2021-10-20黄丽波王金全高文博陈红菊侯衍猛袁学军王春阳

中国农业科学 2021年18期

黄丽波，王金全，高文博，陈红菊，侯衍猛，袁学军，王春阳✉

1山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2中国农业科学院饲料研究所，北京 100081； 3山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271000

0 引言

【研究意义】由镰刀菌产生的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）在霉变粮食中最为常见[1]，已有研究证实ZEA在动物体内产生的生物学反应与雌二醇类似[2-4]，影响子宫内膜细胞的生长[5]、卵母细胞的成熟及卵泡颗粒细胞的增殖[6]。尽管ZEA与雌激素受体的亲和力较低，但是ZEA可通过与雌激素受体的作用而激活雌激素敏感基因，产生生殖毒性。【前人研究进展】大量研究证实摄入一定量的ZEA污染食物可导致生殖器官发生病变或功能障碍[7]，母猪不发情的比率升高，ZEA增加青春期的母猪假孕的发病率，繁殖率大大降低[8]，而且以仔猪表现更为明显[9-12,13]，而RAINEY等[14-15]认为ZEA对于青春期前的母猪不会引起其青春期发情时间的推迟，而母猪随后的繁殖能力并没有受到损害。ZEA对生殖细胞毒性作用的研究结果表明，ZEA能引起牛卵母细胞的染色体结构异常[7]，也可以造成精子染色体结构异常[16]，ZEA导致细胞凋亡、DNA片段化以及产生微核等病理变化，并具有浓度依赖性[17]。【本研究切入点】自噬是细胞维持自身的稳态保护机制[18-19]，但关于ZEA对子宫内自噬蛋白LC3的影响还未见相关报道。在饲料中添加霉菌毒素吸附剂是目前普遍采用的解决霉菌毒素污染问题的方法。通过减少消化系统对霉菌毒素的吸收率，进而减弱霉菌毒素对动物机体的影响。目前，已经有大量关于吸附剂的研究[10,20-22]，虽然天然和合成的吸附剂都可以吸附霉菌毒素，降低其在动物机体内的毒性，但吸附效率不同，其主要取决于每种吸附剂的特性和相应毒素的特性。【拟解决的关键问题】本文通过观察母猪采食不同浓度由沸石+蒙脱石及生物制剂等组成的复合ZEA吸附剂处理的饲料后子宫中LC3与PCNA表达变化，从组织化学角度探讨该ZEA新型吸附剂的脱毒效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

选择体重为30±2.11 kg左右的健康三元杂交（杜×长×大）杂交后备母猪48头作为试验动物。将后备母猪随机分为6组，每组 8头，对照组（control）饲喂基础饲粮（含有 ZEA 0.195 mg·kg-1，呕吐毒素（DON） 1.27 mg·kg-1，烟曲霉毒素（FUM）5.29 mg·kg-1）、玉米赤霉烯酮组（ZEA）饲喂含有 1.0 mg·kg-1ZEA（ZEA 1.008 mg·kg-1，DON 1.43 mg·kg-1，FUM 5.85 mg·kg-1）的饲粮、0.1%新型吸附剂组（ZEA0.1）饲喂含有1.0 g·kg-1新型吸附剂（沸石+蒙脱石及生物制剂等复合制剂）的玉米赤霉烯酮组日粮、0.25%新型吸附剂组（ZEA0.25）饲喂含有 2.5 g·kg-1新型吸附剂的玉米赤霉烯酮组日粮、0.5%新型吸附剂组（ZEA0.5）饲喂含有5.0 g·kg-1新型吸附剂的玉米赤霉烯酮组日粮、蒙脱石组（ZEA+M）饲喂含有2.5 g·kg-1蒙脱石的玉米赤霉烯酮组日粮。预试期7d，正试期 21 d。本试验是2018年完成于山东农业大学创新科技园区动科试验站。

后备母猪饲养标准参考NRC（2012）推荐的饲粮配制量。同时先进行饲粮中黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）、ZEA、DON和FUM含量的检测，饲粮组成及营养水平见表1。

表1 饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Ingredients and nutrient levels of basal diet (air dry basis)

1.2 试验日粮的配制

ZEA日粮[9]：ZEA色谱纯度达98%，购自以色列Fermentek 公司。先将30 g的 ZEA粉溶解在3.0 L乙酸乙酯中制成溶液，再将该乙酸乙酯溶液喷洒到30 kg滑石粉载体上，放置过夜，使乙酸乙酯完全挥发，制成ZEA预混剂，然后再用玉米粉（制备基础日粮）进一步稀释成含量为10 mg·kg-1的 ZEA 玉米粉预混剂，最后按照试验日粮中 ZEA的设计水平，用 ZEA 玉米粉预混剂替代配方中的玉米和载体配制成添加量为1.0 mg·kg-1ZEA组试验日粮。

吸附剂日粮：在ZEA组试验日粮基础上按照相应的设计比例进行添加试验用的吸附剂进行日粮配制。新型吸附剂成分由沸石、蒙脱石及生物制剂等按照一定比例制成的复合制剂（前期体外吸附试验结果已经确定了沸石、蒙脱石及生物制剂等的合适配比，新型吸附剂由王金全实验室研制）。

所有的试验饲料需要在试验开始前一周一次性配制完成，并进行养分含量分析及毒素水平检测（采用HPLC高压液相法）工作，日粮毒素含量检测结果：基础日粮 ZEA 水平为 0.195 mg·kg-1、DON 为 1.27 mg·kg-1、FUM 为 5.29 mg·kg-1，ZEA 组日粮的 ZEA 含量为 1.008 mg·kg-1、DON 为 1.43 mg·kg-1、FUM 为5.85 mg·kg-1。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 样本采集试验结束后，将猪电击放血致死，迅速取出子宫，称重并采集两份样品，一份液氮中速冻后-80℃冰箱保存，用于进行检测 LC3 、PCNA的mRNA 及蛋白相对表达量。另一份样品置于Bouin’s液中固定，用于免疫组化分析。

1.3.2 免疫组化（超敏二步法）取 Bouin’s 液中固定好的子宫组织进行流水冲洗，经常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡后，制成石蜡组织块，用切片机（LEICA RM2135，德国）制成5 μm厚的连续切片。

免疫组化程序：将子宫组织进行石蜡切片经常规脱蜡、脱苯至水后，置于 0.01 mol·L-1，pH 6.0 的柠檬酸缓冲液中进行抗原热修复（微波修复）3次，5 min/次，而后经 PBS（0.01 mol·L-1，pH 7.2）洗 3 次，5 min/次（PBS洗，下同）；再用10 % H2O2进行阻断内源性过氧化物酶，37 ℃恒温箱内孵育 30 min，PBS洗3次；第四步加5% 胎牛血清在37℃恒温箱内孵育1 h，以封闭组织和试剂中的游离电荷；第五步：甩去组织上的血清，加兔抗LC3多克隆抗体（1﹕200，bs-8878R，北京博奥森生物技术有限公司）和鼠抗PCNA单克隆抗体（1﹕200，ZM-0213，北京中杉金桥生物技术有限公司），4 ℃冰箱内孵育过夜，次日用PBS 洗3次后滴加二抗，按照抗兔/抗鼠 Polink-2 plus® 超敏二步法免疫组化检测试剂盒说明进行操作（PV-9001/9002，北京中杉金桥生物技术有限公司）。显色：用 DAB在显微镜下进行显色（RA110，TIANGEN），最后用苏木精复染，经过上行脱水、透明、封片处理，观察结果。阴性对照的一抗采用 PBS 代替，其他步骤相同。

1.3.3 子宫LC3、PCNA的mRNA相对表达量检测根据GenBank报道的猪的LC3、PCNA和GAPDH基因序列，设计相应的特异性引物，送至华大公司进行引物合成（表2）。

在高粱种植过程当中，种植人员要做好田间管理工作，促进高粱根系的发育成长，确保高粱茁壮成长，为后期高粱成长提供重要的保障基础。当苗长出3片叶时，此时需要做好除草与间苗工作，确保其密度合理，提升整齐度。间苗时，需要除去若苗，留住壮苗与健壮苗。当高粱苗长出4片叶时，按照每穴一株的标准进行定苗操作。如若出现缺株的情况下，需要对其进行及时补株，在进行间苗与定苗时，需要确保该工作在晴天下午进行。主要是为了降低养分与水分的消耗，为幼苗成长提供重要的条件基础。

表2 RT-PCR反应的引物序列Table 2 primer sequences of RT-PCR reaction

子宫总 RNA的提取用 Trizol 法，分析RNA浓度和纯度，根据PrimeScript RT Master Mix 反转录试剂盒（RR036A，TaKaRa）说明进行试验操作，反转录的反应体系总体积是20 μL。

qRT-PCR 试验按照 SYBR Premix® Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（DRR420A，TaKaRa）试剂盒说明进行。反应体系总体积为 20 µL，体系组成：dH2O 6.8 µL；SYBR Primerx Ex Taq 10 µL；上游引物 0.4µL；下游引物 0.4 µL；cDNA 2 µL（＜100 ng）；ROX Reference DyeⅡ 0.4 µL。每个子宫样品进行3个重复。扩增反应使用仪器为 ABI 7500 Real-time PCR 仪，反应条件：预变性 30s、95 ℃，变性 5s、95 ℃，退火延伸 34s、60 ℃，15s、95 ℃，60s、60 ℃，15 s、95 ℃，40个循环。

1.3.4 LC3与PCNA的Western blot分析将 -80℃冰箱保存的50—70 mg子宫组织经液氮研磨后提取总蛋白质，BCA法测子宫总蛋白浓度。电泳的上样体积为20 μL，蛋白含量50 μg，经电泳分离蛋白、转膜后，将PVDF膜置于5% 脱脂奶粉中，在室温封闭孵育2 h后，分别添加一抗（兔抗 LC3多克隆抗体，1﹕300，北京博奥森生物技术有限公司；鼠抗PCNA单克隆抗体，1﹕350，ZM-0213，北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，1﹕300，碧云天生物技术有限公司），并在4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗 3次，10min/次；再加二抗（山羊抗鼠IgG，1﹕2 000，康为世纪，山羊抗兔 IgG，1﹕2 000，康为世纪），37℃恒温箱孵育 2 h，TBST 洗 3次； ECL法显色（BeyoECL Plus P0081，碧云天生物技术有限公司），图像采集用Fusion FX7高端多功能成像系统（北京五洲东方科技发展有限公司）。

1.4 数据分析

采用 Image pro-Plus 6.0 软件分析子宫腔上皮和腺上皮的免疫阳性反应物质的累积光密度（Integrated optic density, IOD）。运用 2-△△CT方法分析 mRNA 的相对表达量。Western blot统计结果是以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值表示。采用SPSS17.0 软件统计分析试验数据，以平均值±标准误（mean±SEM）表示。

2 结果

2.1 子宫器官指数

ZEA引起后备母猪子宫器官指数（子宫重g/体重kg）显著增加，在添加新型吸附剂后，子宫器官指数均明显降低，与ZEA组差异显著（P＜0.05），ZEA0.25组与对照组相近。提示添加一定剂量的新型吸附剂能够减弱子宫的异常增殖情况的发生，添加蒙脱石吸附剂（ZEA-M）组的子宫器官指数降低效果也较好（P＜0.05）。

表3 子宫器官指数Table 3 The organ index of uterus

2.2 子宫 LC3 分布

免疫组化结果显示在后备母猪的子宫细胞胞质内LC3 阳性反应物质呈黄色和棕黄色。子宫中的 LC3阳性细胞主要分布在子宫腺上皮，而腔上皮次之，组间 LC3的分布与阳性反应强弱差别明显（图 1-A1、B1、C1、D1、E1、F1）。而固有层的基质细胞与肌层的平滑肌细胞胞质内未见有 LC3免疫阳性物质存在。

对照组的子宫腺上皮LC3阳性细胞的胞质呈棕褐色，强阳性表达。在腔上皮细胞内（图1-A3）的LC3免疫阳性反应弱于腺上皮细胞（图1-A2、A4）。

ZEA组LC3阳性反应明显弱于对照组，在子宫腺上皮中可见少量 LC3阳性反应细胞分布（图 1-B2、B4），胞质呈弱阳性反应，染成黄色；在子宫腔上皮细胞偶见呈淡黄色的LC3弱阳性物质分布（图1-B3）。

ZEA0.1（图 1-C2、C3、C4）、ZEA0.25（图 1-D2、D3、D4）和ZEA0.5组（图1-E2、E3、E4）的LC3阳性细胞分布的观察结果显示均较ZEA组增强，腺上皮细胞的免疫阳性反应及阳性细胞数量明显增加，呈棕黄色（图 1-C2、D2、E2、C4、D4、E4）：腔上皮细胞内偶见呈淡黄色的阳性物质（图1-C3、D3、E3）。LC3免疫阳性反应及阳性细胞数量存在吸附剂剂量依赖趋势。但ZEA0.5组LC3免疫阳性反应仍弱于对照组（图1-A3、A4）。

ZEA-M组的LC3免疫阳性细胞分布特点及阳性反应强度（图1- F2、F3、F4）与ZEA组相似（图1-B3、B4），主要分布在子宫腺上皮（图1-F2、F3、F4），呈黄色，但阳性细胞数量较ZEA组增多。

2.3 子宫的 PCNA 的分布

后备母猪子宫内PCNA为细胞核着色，免疫阳性反应物质呈深棕色、棕黄色或黄色，子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞阳性反应强度相近（图2-A1、B1、C1、D1、E1、F1），基质细胞与肌层平滑肌细胞胞核内可见有PCNA弱免疫阳性物质分布。

对照组的子宫腺上皮PCNA阳性细胞的胞质呈黄色，弱阳性表达（图2-A2）。在腔上皮内（图2-A3）的PCNA免疫阳性细胞比例少于腺上皮（图2-A4）。

ZEA组PCNA阳性反应明显强于对照组，呈深棕色，在子宫腔上皮和腺上皮中可见大量PCNA阳性反应细胞分布（图 2-B3、B4）。肌层内呈现的 PCNA阳性反应的平滑肌细胞明显增多。

ZEA 0.1（图2-C3、C4）、ZEA0.25（图2-D3、D4）和 ZEA0.5组（图 2-E3、B2、E4）的 PCNA 阳性细胞分布的观察结果显示均较ZEA组减弱，腔上皮（图 2-C3、D3、E3）和腺上皮细胞的阳性反应及阳性细胞数量明显减少，呈棕黄色（图2-C2、D2、E2、C4、D4、E4）：PCNA阳性反应及阳性细胞数量存在吸附剂剂量依赖趋势。但ZEA0.5组（图2-E3、E4）PCNA阳性反应仍强于对照组（图2-A3、A4）。

ZEA-M组的PCNA阳性细胞分布特点及阳性反应强度（图2-F3、F2、F4）与ZEA组相似（图2-B3、B2、B4），呈棕黄色，但阳性细胞数量较ZEA组减少。

2.4 子宫内LC3及PCNA的阳性反应IOD、蛋白和mRNA相对表达量分析

通过分析子宫腔上皮中的LC3阳性反应的 IOD的结果表明：对照组显著高于 3个新型吸附剂组及ZEA-M组（P＜0.01，图3），ZEA0.25组高于ZEA组（P＜0.05，图3），ZEA-M组最低，但与ZEA组和ZEA0.1差异不显著（P＞0.05，图3）；而腺上皮的 IOD结果明显高于腔上皮，且新型吸附剂组的变化趋势与腔上皮一致，除ZEA0.1与ZEA-M两组之间无明显差异外（P＞0.05，图 3），其他各组间均呈显著性差异（P＜0.01，图 3），ZEA组腺上皮的IOD值最低，对照组腺上皮的 IOD值最高。LC3 mRNA和蛋白相对表达量结果显示，ZEA组较对照组显著下降（P＜0.05，图 3），添加新型吸附剂后LC3蛋白相对表达量增加，ZEA 0.1组、ZEA0.25组较ZEA组LC3升高，mRNA水平上呈显著性差异（P＜0.05，图3），但蛋白表达量结果是差异不显著；ZEA组及 ZEA-M 组相比较差异不显著（P＞0.05，图3），ZEA0.5组LC3蛋白表达量最高，但仍低于对照组，无显著性差异。

子宫腔上皮和腺上皮中 PCNA阳性反应的 IOD的结果与LC3变化趋势相反（图4），对照组最低，ZEA组最高，ZEA-M组与ZEA组相近，新型吸附剂3组的PCNA阳性反应的 IOD呈现递减趋势，ZEA0.5组显著低于ZEA0.1、0.25组（P＜0.01，图4），PCNA mRNA和蛋白相对表达量结果也与 LC3变化趋势相反，ZEA组表达量最高（P＜0.05，图4），而ZEA0.5组最低（P＜0.05，图4）。

3 讨论

玉米、小麦、大豆、油菜等各种作物均可以被镰刀菌侵染，猪对镰刀菌毒素的毒性作用最易感[8-11]。有关镰刀菌毒素对人和畜禽影响的研究结果很多，ZEA 不仅影响家畜的饲料转化效率[10]，增加子宫的体积、重量及器官指数[9，11]，而且可促进卵巢内原始卵泡的提前发育[11]，而本研究结果发现饲喂1.0 mg·kg-1ZEA同样使后备母猪子宫体积增大，器官指数增加，与笔者前期在仔猪上的研究添加 ZEA 的增加效果相一致[11]。

研究显示ZEA可抑制DNA和蛋白质的合成、干扰细胞分裂周期、抑制细胞活性进而导致细胞凋亡，这是ZEA细胞毒性作用的典型体现，并具有浓度依赖性[17-19]。1962年，ASHFORD 和 PORTER 首次在肝细胞内发现存在自噬现象。随后研究显示细胞自噬是另一种形式的程序性细胞死亡，当细胞处于营养缺乏和压力等条件下，细胞通过自噬用来补偿和维持机体动态平衡[23]。意味着自噬实际上是机体细胞的一种保护机制，正常状态下自噬维持着细胞内的稳态，如果抑制自噬，细胞的生存能力可能会降低，自噬水平的异常（升高或降低）会直接影响生物体及细胞正常生理功能的发挥，进而导致许多疾病如：肿瘤、阿尔兹海默病的发生发展[20]。已经证实LC3是自噬体完成后试验监测的卓越标记[24-25]。近年来，越来越多的证据表明在子宫内膜基质细胞和上皮细胞内发现存在自噬现象，自噬在与子宫内膜相关的生理和病理生理过程中也起着至关重要的作用，包括周期性月经、正常妊娠期间子宫内膜的蜕膜化或重构等与子宫内膜相关的疾病[26]。ZHOU研究表明，卵巢切除大鼠和围绝经期女性的子宫内膜发生萎缩，自噬被激活，使得子宫上皮细胞中 LC3蛋白表达上调[27]。本试验中添加 1.0 mg·kg-1的ZEA促进猪子宫壁增厚，与子宫萎缩相反，LC3蛋白表达下降的结果与上述试验结果相一致，本结果也间接提示ZEA抑制了LC3的表达，破坏子宫内膜细胞和腺上皮细胞的稳态，进一步可能引起病理变化。但新型吸附剂使 LC3蛋白表达上调，抵抗由ZEA引起的子宫内膜细胞异常增殖（PCNA表达增加），对细胞起到一定程度的保护作用。这与文献证实的人子宫内膜细胞中发生自噬具有促进凋亡作用的结果相一致[28]。DAI等报道[11]，断奶仔猪饲喂含1.04 mg·kg-1ZEA饲料，导致仔猪生长卵泡异常增殖，PCNA的IOD、蛋白质和mRNA相对表达量均大于对照组。本试验结果也证实ZEA的添加，诱导后备母猪子宫内PCNA免疫阳性细胞增多，蛋白表达升高。

霉菌毒素吸附剂是目前解决霉菌毒素污染最可行的方法，目前国内市场上有多种霉菌毒素吸附剂产品，但吸附效率和产品质量参差不齐。吸附剂与霉菌毒素结合或者生物降解 ZEA是一个可靠且很有应用前景的策略，但由于成本等现实问题，对于吸附剂的研究一直是当今的研究重点[29-30]。沸石在动物营养中广泛应用。其能够使动物更有效地利用饲粮的营养，改善肠道内微生物群落及消化机制，减少动物机体被霉菌毒素损害的影响。沸石和蒙脱石的四面体晶体结构特点十分相似，巨大的表面积使其有较强的离子交换性和吸水膨胀性能；JIANG的试验结果显示改性蒙脱石对 ZEA有明显的脱毒效果[31]。本试验结果显示由沸石、蒙脱石及生物制剂等组成的新型吸附剂能够降低子宫体积和器官指数，缓解子宫的异常增殖，对子宫有保护作用，并且以 0.25%剂量效果较好，较蒙脱石的脱毒效果更佳。而此新型吸附剂使得LC3表达上调、PCNA表达降低也提示新型吸附剂的正向作用效果，对ZEA致子宫增殖肥大毒性的保护作用明显。本试验研究结果显示，在添加新型吸附剂后，随着吸附剂剂量提高，子宫腔上皮细胞 LC3免疫阳性反应升高，PCNA降低，基本恢复了子宫的正常生理。以0.5%添加剂量效果较好。这与 LIU等证实藏红花素抑制PCNA的表达对小鼠的子宫内膜异位症有保护作用的研究结果相一致[32]。