NLRP3炎症小体在痛风性关节炎中的作用及中药干预研究进展

史悦悦 张晓熙 楚秉泉 夏道宗

浙江中医药大学药学院 杭州 310053

痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）是一种由嘌呤代谢紊乱所引起的代谢性疾病，其特征是尿酸来源增多或去路减少，造成体内尿酸代谢失衡，过多尿酸盐以晶体形式沉积在关节囊、软骨等部位，刺激炎症产生[1]。GA的发病率逐年增长，且呈年轻化趋势，严重影响了患者的生活质量及工作效率[2]。针对痛风，西医多采用抗炎药物或降尿酸药物治疗，具有较好疗效，但停药后易复发，且存在较多不良反应，如秋水仙碱易引起胃肠道反应、别嘌呤醇易引起皮疹等过敏反应[3]。中医中药治疗痛风多以脾虚湿热瘀阻为辨证要点，通过清除患者体内的湿、热、瘀、毒之邪，并调和机体脏腑阴阳，达到协同治疗的效果。相较于西药，中药治疗从整体出发，通过辨证论治，对于复杂的病情判断较为准确，临床疗效更为突出，在控制病情发展、降低不良反应等方面具有独特的优势，因此，中药很可能成为未来抗痛风领域研究的热点[4]。

Nod样受体蛋白3（nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎症小体又称Cryopyrin，最早在Muckle-Wells自身炎症性疾病综合征中被发现[5]。现已证明，NLRP3炎症小体是许多疾病的重要治疗分子靶点，在肺损伤[6]、心血管疾病[7]、帕金森综合征[8]及GA[9]的治疗研究中具有重要地位。NLRP3炎症小体由NLRP3支架、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）和效应蛋白半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1） 三部分组成。作为固有免疫的重要组成部分，NLRP3炎症小体的激活和白细胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）的释放在痛风进展中发挥了重要作用。本文基于NLRP3炎症小体在GA中的作用，拟对中药复方、单味中药提取物、中药单体化合物治疗GA的研究进行系统梳理，以期为GA治疗药物的研发提供参考。

1 NLPR3炎症小体与GA的关系

GA是一种自身炎症性疾病，当血尿酸浓度过高时，尿酸以钠盐的形式沉积在关节中，引起组织异物炎性反应，因此先天免疫反应是GA组织破坏和炎症反应的主要驱动力。2006年，Martinon等首次报道了尿酸钠（monosodium urate，MSU）晶体能够刺激NLRP3炎症小体的激活，促进IL-1β的成熟活化[10]。同时有研究发现，GA患者关节滑膜中NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的mRNA和蛋白表达增高[9，11-12]。 GA模型小鼠的关节匀浆中，NLRP3炎症小体、核因子-κB/p65（nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65） 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的蛋白表达也明显增加，NLRP3、ASC和caspase-1基因敲除小鼠则无法在MSU晶体诱导下产生炎症反应[13]。以上都提示，NLRP3炎症小体的激活与GA密切相关。基于NLRP3炎症小体，现阶段研究所涉及的中药干预机制主要包括：影响活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，抑制NLPR3支架激活，抑制ASC斑点的形成，抑制NLRP3炎症小体的组装，负反馈调节炎症因子产生以及抑制NF-κB对NLRP3炎症小体的激活。MSU激活NLRP3炎症小体，进一步诱发GA的病理机制见图1。

图1 MSU激活NLRP3炎症小体诱发GA的病理机制

2 中药干预NLRP3炎症小体抗GA的研究进展

目前中医将GA归为“痹证”，其临床用药多以清热化湿健脾及补虚为核心，兼顾活血化瘀、利湿除痹。中药包括复方、单味药提取物、单体活性成分，在GA治疗中表现出了明显的优势。在检索的80篇中英文文献中，治疗GA的中药药性多为寒性，药味为甘，主归脾、胃、肾经。基于NLRP3炎症小体治疗GA的相关中药可分为以下几大类：（1）清热药：土茯苓、知母、黄连、青蒿、冬凌草、绿茶、子菜；（2）利水渗湿药：薏苡仁、茯苓、虎杖、菊苣；（3）化湿药：苍术、防己；（4）补虚药：白术、黄芪、白芍；（5）活血化瘀药：牛膝；（6）泻下药：大黄；（7）解表药：桂枝、生姜、野菊花。了解中药的性状归类，对未来靶向药物及其他新药的研究中具有重要意义。

2.1 中药复方 临床上治疗GA的复方数量众多，多在四妙散、当归拈痛汤、萆薢渗湿汤、宣痹汤、桂枝芍药知母汤、桂枝白虎汤、独活寄生汤和五味消毒饮等基础上加减而成[14]。独活寄生汤是治疗GA的传统方剂，疗效显著，该方中几种化合物甘草酸、茯苓酸、龙胆碱和芍药苷起主要作用[15]。临床研究发现，清热除痹汤、痹宁汤能抑制炎性产物IL-1β的表达，可有效提升疗效，降低全身炎症反应，减轻疼痛[16-17]。加味黄芪桂枝五物汤由黄芪、桂枝、白芍、川芎、牛膝组成，动物实验证实其能通过下调NLRP3表达，上调保护性细胞因子转化生长因子-β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）表达，有效改善关节的肿胀度，说明其作用机制与NLRP3炎症小体相关[18]。知黄痛风汤能够通过增加β-抑制蛋白2（β-arrestin 2，ARRB2） 表达，抑制NLRP3炎症小体生成，从而抑制炎症因子IL-1β、IL-18的产生，减轻GA的症状[19]。另有研究表明，桂枝芍药知母汤抗GA的作用机制可能与降低中性粒细胞NLRP3、ASC表达，抑制NF-κB活化及IL-1β分化成熟有关；此外还能够增加caspase-12表达，负反馈抑制NLRP3炎性小体信号通路激活，发挥抗痛风作用[20]。萆薜除痹汤能够下调磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）通路，抑制NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β蛋白和基因的表达，从而防治GA[21]。 研究表明，MSU和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）同时刺激THP-1细胞可模拟出GA体外细胞模型，加味三妙丸能明显下调该模型NLRP3、ASC、caspase-1、髓样分化因子88（marrow like differentiation factor 88，MyD88）、Toll样受体2（toll-like receptor 2，TLR2）、Toll样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）等蛋白的表达，且具有剂量依赖性，其机制与调控NLRP3炎性体轴和NF-κB信号通路密切相关[22-23]。现阶段已知中药复方抗GA的研究中，NLRP3炎症小体的相关上游信号通路受到影响，但中药复方是否能直接结合NLRP3炎症小体，有待进一步挖掘。

2.2 单味中药提取物 与中药复方相比，单味中药成分相对清晰，对于中药开发的进一步研究有着重要的作用。单味中药既可以单独发挥疗效，同时也可以与其他药物协同产生效应，因此单味药研究是进一步研究的重要基础。比如，牛膝总皂苷能够有效地缓解GA模型小鼠的活动减少、关节肿胀等症状[24]。白芍总苷、土三七提取物能够降低GA小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平[25-26]。研究发现，畲药三脚风炉水提物能够调节NLRP3炎症小体，抑制炎性因子IL-1β的表达[27]。GA模型小鼠活动量减少，关节浸出液中IL-1β、IL-6和IL-18水平显著增高，炎性细胞浸润明显，滑膜组织中可见NLRP3、ASC、caspase-1前体和活性形式蛋白表达增高，而土茯苓总黄酮 （total flavonoids of Smilax glabra Roxb，TFSG）、虎杖醇提物（ethanolic extract of polygonum cuspidatum，PCE）对上述指标具有不同程度的改善作用，其作用机制可能与调控NLRP3/ASC/caspase-1信号通路有关[28-29]。野菊花提取物通过调节ASC磷酸化，同时抑制NLRP3和AIM2炎症小体激活，从而能够抑制促炎因子的分泌和中性粒细胞的募集[30]。对白子菜提取物改善GA的研究发现，IL-1β与caspase-1、ASC、NLRP3存在显著相关性[31]。 这些实验结果表明中药单味药提取物治疗GA，与NLRP3炎症小体密切相关。

2.3 中药单体化合物 在中药复方和中药单味提取物的研究基础上进一步研究中药单体化合物，对于靶向治疗及新药开发意义重大。黄芩苷、姜辣素能够抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达，并减少大鼠踝关节炎性细胞浸润[32-33]。橙皮苷甲基查尔酮对GA的抗炎作用依赖于抑制NF-κB信号通路的转导调控[34]。青蒿素及其衍生物可下调经MSU晶体及LPS处理的巨噬细胞中NIMA相关激酶7（recombinant human NIMA-related kinase 7，NEK7）-NLRP3的相互作用，减少急性GA模型小鼠细胞中钾离子外流[35-36]。通过检测急性期痛风患者、间歇期痛风患者和健康体检者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）数量，研究发现急性期和间歇期痛风患者外周血PBMCs的沉默信息调节蛋白1（sirtuin1，SIRT1）mRNA及蛋白水平均低于健康体检者，NF-κB/p65 mRNA和IL-1β蛋白水平均高于健康体检者。体外MSU干预PBMCs的实验验证，白藜芦醇干预组的SIRT1蛋白水平显著高于MSU组，NF-κB/p65 mRNA及IL-1β蛋白水平则显著降低[37]，说明MSU晶体引起的炎症和关节功能障碍，受到NF-κB信号通路的调控。研究发现，槲皮素能够抑制NLRP3的上游信号传导，通过抑制核因子-E2相关因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信号来抑制炎症，而HO-1小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可消除槲皮素对NLRP3的抑制作用[38]，说明中药单体化合物抗GA的机制与ROS的变化密切相关。进一步研究表明，姜黄素、绿茶中的表没食子儿茶素没食子酸酯能够抑制小鼠原代巨噬细胞线粒体DNA的合成和ROS的产生[39-40]。桉油醇能减轻MSU诱导的体内抗氧化酶活性的增加和ROS的降低；同时可减弱MSU诱导的踝关节组织和支配踝关节的背根节神经元的瞬时感受器电位香草酸受体1 （transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）表达上调，抑制NLRP3炎症小体的生成，干预GA的进程[41]。冬凌草甲素能够通过与NLRP3炎症小体279位的半胱氨酸靶向结合，激活NLRP3的核苷酸偶联结构域 （domain present in NAIP，CIITA，HET-E and TP1，NACHT），对其NLRP3-NEK7区域产生抑制作用，从而抑制NLRP3炎症小体活化，其机制可能与抑制NLRP3炎症小体装配和激活有关[42-43]。黄连碱是中药黄连的特征性成分，能够与caspase-1特异性结合，是有效的caspase-1抑制剂[44]。大黄酸通过抑制NLRP3和ASC的聚集，影响NLRP3炎症小体的形成，从而抑制caspase-1的表达及活性，最终阻止炎症信号通路的激活，发挥防治GA的作用[45]。目前大黄酸已被国家科技部列为“十五”国家重大科技专项研究对象，证明中药单体的研究正从实验室走向临床，也预示着中药在控制病情发展、降低不良反应等方面的独特优势。因此，中药有效单体的研究很可能成为未来抗痛风领域研究的热点。

中药复方、单味药提取物及单体化合物干预NLRP3炎症小体抗GA的进展总结见表1。

表1 中药复方、单味药提取物及单体化合物干预NLRP3炎症小体抗GA的机制

3 讨论

现阶段针对NLRP3炎症小体的相关机制研究包括ROS产生和线粒体功能障碍、氧化线粒体DNA释放、钾离子外流、破坏的溶酶体释放组织蛋白酶B、细胞外钙离子梯度的变化，磷酸化和泛素化以及跨膜孔的形成等方面。除此之外，NEK7、microRNAs诱导NLRP3炎症小体失活也是研究重点[46]。黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）-NLRP3双靶向抑制剂能够同时降低尿酸和减轻炎症，这可能是今后治疗GA的一个有前途的方法[47]。

NLRP3炎症小体在中医药治疗GA中发挥了重要作用，但中药复方成分复杂，因此尚未深入系统探讨其机制，目前研究仅还局限在上调保护因子TGF-β1[18]、抑制NLRP3/NF-κB信号转导[15]、抑制TLR/NF-κB信号转导[16]等方面。经典方剂和民间医药往往具有更好的临床基础，疗效显著。目前以中药有效提取物为基础，进行“新配伍”的相关研究成为新热点。单味中药提取物成分相对于复方较少，成分更加明确，是进一步临床研究必不可少的基础。而部分中药单体化合物，已被证明能够与蛋白质活性部位结合从而发挥药理作用，如：黄连碱通过与caspase-1活性部位结合，直接抑制NLRP3炎症小体激活[44]；蒽醌类药物大黄酸，虽不能直接影响NLRP3与ASC的表达，但是能够阻止其聚集，从而发挥作用[45]。

中药能够通过干预NLRP3炎症小体治疗GA，但相关机制有待深入研究，NLRP3炎症小体激活调控的过程中是否还有其他蛋白的介入也有待考证，因此未来研究的重要方向是进一步明确NLRP3炎症小体相关通路之间的关系。同时在对GA进行研究的同时，应以NLRP3炎症小体为核心，寻找治疗相关并发症的方法，并开发高效低毒的新药。