复方地黄颗粒治疗帕金森病胃肠动力障碍

张建英，王 利，何建成*

（1.云南中医药大学，昆明 650500；2.上海中医药大学，上海 201203）

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是以震颤、肌强直、运动减少和姿势异常为特征的慢性神经系统变性疾病，但认知功能障碍、精神障碍、睡眠障碍、自主神经功能障碍和感觉障碍等非运动障碍在PD的发生率也较高[1]。在非运动症状的自主神经功能障碍中，以消化道功能障碍的表现较常见，流涎、吞咽困难、胃排空延迟、便秘等胃肠功能障碍严重影响患者的生活质量[2]。复方地黄颗粒是上海中医药大学何建成教授开发的临床治疗PD的有效中药制剂。前期的研究证实，复方地黄颗粒对PD的作用机制与调控神经递质、细胞凋亡、DA代谢、神经营养因子及部分细胞信号通路等有关，长期服用未见不良反应[3]。本实验进一步观察复方地黄颗粒对阴虚动风证PD病证结合动物模型并发胃肠动力障碍症状的治疗作用，并初步探索其作用机制。报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠150只，雄性，体质量180～200 g，上海中医药大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（沪）2014-0008。饲养条件：相对湿度60%～65%，恒温（23±2）℃，自动光-暗控制（7:00—19:00光照，19:00—次日7:00暗置），动物摄食、饮水及活动自由。

1.2 试剂与仪器

戊巴比妥钠（pentobarbital sodium），上海中西药业股份有限公司，批号WS20130112；6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine hydrochloride，6-OHDA），Sigma 公司（美国），批号MKBJ8207V；阿扑吗啡[R-（-）-apomorphine hydrochloride hemyhydrate，APO]，Sigma公司（美国），批号SLBG0333V；抗坏血酸（vitamin C），Selleck公司（美国），Cat No：S3114，Lot：01。磷酸盐缓冲液（PBS），高压灭菌（至少 20 min）保存于室温或4℃冰箱中；EDTA（pH 9.0，×50），MVS-0098，批号160509425F；山羊血清，中杉金桥（ZLI-9021）；二步法免疫组化试剂盒，中杉金桥PV-6002 ；DAB显色液，中杉金桥（ZLI-9019）；c-kit（D13A2）XP®Rabbit mAb，Cell Signaling Technology，Catalog number：3074，145kDa。大鼠脑立体定位仪，RWD-68003 型，深圳瑞沃德生命科技有限公司。光学显微镜，重庆光电仪器有限公司，型号XSP-C204；烘箱，上海精宏实验设备有限公司，型号DGX-9003B；切片机，上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016。

复方地黄颗粒：熟地黄、丹参、白芍、钩藤、石菖蒲、全蝎、珍珠母，按照既定工艺制成浸膏粉（国家中药制药工程技术研究中心制备）。按孙瑞元《定量药理学》的标准体质量大鼠每日用量方法计算大鼠中药的每日用量。

2 实验方法

2.1 阴虚动风证PD模型制备

实验前确认参与实验大鼠没有自发旋转行为。麻醉（3%戊巴比妥钠，0.25 mL·100 g-1），固定（利用大鼠脑立体定位仪），手术（行右侧黑质损毁术）。依据包新民主编的《大鼠脑立体定位图谱》找到前囟，确定第一点坐标（前囟后 5.2 mm，中线右侧1.0 mm，硬膜下9 mm），第二点坐标（前囟后5.2 mm，中线右侧1.5 mm，硬膜下8.5 mm）。标记，轻缓钻透颅骨，用微量注射器抽取6-OHDA 溶液（含0.2% 的抗坏血酸的溶液配制，浓度2 μg·μL-1），每点注射3 μL。以 1 mm·min-1速度进针，注射6-OHDA 溶液的速度为 1 μL·min-1，注射完毕留针5 min。再按 1 mm·min-1速度缓慢拔针，缝合皮肤。6-OHDA 注射 4 周后，腹腔注射阿扑吗啡（Sigma，0.5 mg·kg-1，溶解于纯净水0.5 mg·mL-1）诱导首尾相接的左侧旋转行为，记录开始旋转时间和30 min内总旋转圈数，平均每分钟≥7 r的为模型成功[4-7]。本课题组前期从病因、症状、客观指标、方证相应等方面，综合观察了模型动物的变化，证实该动物模型属于阴虚动风证模型[8]。

2.2 动物分组及给药

正常对照组，10只大鼠不造模。将造模成功的PD模型大鼠随机分为PD模型组、中药组，每组10只。正常对照组、PD模型组动物，均灌胃等量生理盐水；中药组灌胃复方地黄颗粒（0.504 g·mL-1）1 mL·100 g-1，每日1次。

给药第6周，收集各组大鼠粪便，测定其含水量，检测胃排空速度：胃排空率=1-（总胃重-胃净重）/灌胃糊剂总量×100%。并剪取胃窦组织固定，留作检测免疫组化，另一部分液氮速冻，-80℃冰冻储存，待检测蛋白表达。

2.3 免疫组化法检测ICC数量

取胃窦组织（约0.5 cm），PBS冲洗干净，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm切片，免疫组化染色，光学显微镜下观察病理改变。

胃窦组织切片常规脱蜡至水后，用Tris 盐酸缓冲液（TBST）[ pH （7.4±0.2）] 洗3次，每次 3 min；组织抗原行水浴法热修复；30 mL·L-1过氧化氢阻断内源过氧化物酶，TBST洗3次；用正常非免疫动物血清室温孵育 10 min；同一组织相邻切片加入一抗，4℃过夜；TBST洗3次后，加入生物素标记第二抗体室温孵育20 min；TBST洗3次，加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶室温孵育20 min，二氨基联苯胺（DAB） 显色，中性树胶封固。所有切片在同一条件下采用Image-Pro®Plus （IPP）分析系统分析其平均光密度值。

2.4 Western blotting法检测c-kit蛋白表达

常规蛋白质抽提，行Western blotting分析。采用Alpha View SA图像分析软件对目标条带进行灰度分析，以β-actin为参照计算相对表达量。

2.5 统计学方法

3 实验结果

3.1 粪便含水量测定与胃排空率比较

与正常对照组比较，阴虚动风证PD病证结合动物模型组大鼠粪便含水量明显降低（P＜ 0.05）；与模型对照组比较，复方地黄颗粒组大鼠粪便含水量显著增加（P＜0.05）。与正常对照组比较，阴虚动风证PD病证结合动物模型组大鼠胃排空率明显降低（P＜0.05）；与模型对照组比较，复方地黄颗粒组大鼠胃排空率明显增加（P＜0.05），与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠粪便含水量与胃排空率比较（±s，n=10） %

表1 各组大鼠粪便含水量与胃排空率比较（±s，n=10） %

注：与正常对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 粪便含水量 胃排空率正常对照组 60.21±2.53 61.84±7.38模型组 44.42±3.15# 45.53±5.36#复方地黄颗粒组 62.85±4.51△ 59.45±6.84△

3.2 胃窦部C-kit免疫反应阳性细胞ICC数量

在×400镜下，每个部位每个层次随机选取10个视野，计数ICC阳性胞体个数之和。免疫组织化学法染色后ICC呈现棕黄色，分布在肌间、肌内、黏膜下、深肌层，为梭形、圆形、多角形和不规则形等，高倍光镜下容易辨别。与正常对照组比较，阴虚动风证PD病证结合动物模型组大鼠胃窦部C-kit免疫反应阳性ICC数量明显降低（P＜0.05）；与模型对照组比较，复方地黄颗粒组大鼠胃窦部C-kit免疫反应阳性ICC数量明显增加（P＜0.05），与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠胃窦全层ICC数量、c-kit蛋白表达比较（±s，n=5）

表2 各组大鼠胃窦全层ICC数量、c-kit蛋白表达比较（±s，n=5）

注：与正常对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 胃窦ICC数量 胃窦c-kit蛋白表达正常对照组 231.05±26.25 0.65±0.09模型组 186.45±26.72# 0.28±0.16#复方地黄颗粒组 236.18±27.53△ 0.62±0.13△

3.3 胃窦c-kit蛋白表达结果

与正常对照组比较，阴虚动风证PD病证结合动物模型组大鼠胃窦部 c-kit蛋白表达量明显降低（P＜0.05）；与模型对照组比较，复方地黄颗粒组大鼠胃窦部 c-kit蛋白表达量明显增加（P＜0.05），与正常对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。见表2，图1，图2。

图1 阴虚动风证PD大鼠胃窦c-kit蛋白表达变化及复方地黄颗粒的干预作用

图2 各组大鼠胃窦c-kit蛋白表达比较

4 讨论

复方地黄颗粒由熟地黄、钩藤、珍珠母、白芍、丹参、石菖蒲、全蝎等药物组成，诸药合用，滋补肝肾，熄风化痰，散结活血，平肝解毒，对PD运动障碍及部分并发症有较好疗效。基于前期临床观察服用该方的PD患者排便通畅，本次实验观察其对实验大鼠胃排空、粪便含水量等的作用，并初步探讨其部分机制。

近年来，胃肠动力细胞与胃排空延迟、便秘、腹泻等胃肠动力障碍疾病间的关系备受关注[9]。Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是一组存在于胃肠道的间质细胞，是胃肠起搏细胞，自发产生慢波并传播至平滑肌细胞，调控胃肠平滑肌的收缩节律[10]。肠运动神经细胞释放出的多数神经递质与ICC表达的受体结合，亦产生兴奋或抑制性反应[11]。研究[12]发现c-kit是ICC表面的标记物。

PD患者常伴发胃排空延迟、便秘等症状，本次实验观察到阴虚动风证PD病证结合模型动物胃排空率、粪便含水量降低，与PD临床常伴发症状一致；复方地黄颗粒组实验动物胃排空率、粪便含水量增加，接近正常对照组。进一步观察大鼠胃窦部ICC的相关蛋白c-kit的表达，并且以免疫组化的方法标记ICC数量，结果显示模型组胃窦c-kit蛋白表达减少，ICC数量减少，而复方地黄颗粒组c-kit蛋白表达增加，ICC数量增多。推测该方改善PD便秘症状的作用与c-kit蛋白及其标记的ICC有关。复方地黄颗粒是基于PD的神经运动障碍等进行辨证处方，并非针对胃肠系统直接选方用药，本结果却显示其有效缓解PD伴发的胃肠动力障碍的症状，发挥了中药在临床应用中的多方面功效。相关研究还有待于继续探索。