基于太赫兹光谱快速检测大豆油中的磷脂酸含量

罗淑年，王立琦，于殿宇，王 莹，周 琪，于长华，刘天一*

（1 哈尔滨商业大学 哈尔滨150028 2 东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030 3 九三食品有限公司 哈尔滨150010）

食用油脂是人们生活中不可缺少的能源物质[1]。如果食用油脂中存在磷脂，就会影响油脂的品质，如油脂的色泽和货架期等[2]。脱胶是油脂精炼过程中的关键步骤，主要技术指标为大豆毛油中的磷脂含量[3]。实验室中，检测大豆油脂中磷脂类物质常采用的方法是薄层色谱法[4]（Thin-layer chromatography，TLC）和高效液相色谱法[5]（High performance liquid chromatography，HPLC），此两种方法存在缺陷，如TLC 法定量时需采用薄层扫描仪计算分值，干扰因素多，试验条件严苛，重复性较差[6]；HPLC 法的成本昂贵，同时需要复杂的前处理[7]。实际生产中，常采用280 ℃加热试验的方法检测脱胶后大豆油中磷脂的含量，该方法仅通过观察油脂颜色变化以及絮状沉淀的产生来判定磷脂含量，其结果并不准确。

一般情况下，经水化脱胶后，能够将油脂中的磷脂除去80%左右，剩余磷脂为非水化磷脂，是多种磷脂组分的混合物，主要成分是磷脂酸[8]。寻找一种快速、无损并且精度较高的检测磷脂酸含量的方法显得尤为重要。

太赫兹波（Terahertz，THz）是频率在0.1～10 THz 之间的电磁波，具有透视性、安全性和指纹性等特性[9]。太赫兹时域光谱（Terahertz time domain spectroscopy，THz-TDS）技术是一种崭新的光谱探测技术，该技术基于超短相干脉冲的产生与探测原理[10]，通过测量辐射脉冲的电场振幅，可在其覆盖的频率范围内同时获得太赫兹波的强度和相位信息，在材料的远红外物性研究中有重要的应用。由于脉冲具有低能性，不会使得生物分子产生光致电离，因此它是一种有效的无损检测方法，非常适合于生物分子的研究[11-12]。太赫兹时域光谱分析作为一种检测方法，独特之处是具有较快的分析速度，对样本内部和外表没有任何损坏，能同时获得样本的相位和振幅信息，且能测量分子间弱相互作用以及晶体中晶格低频振动等分子集体振动信息[13]。

THz-TDS 作为一项高新分析技术，近年来得到迅速发展。李利龙等[14]采用透射型THz-TDS 测量两种调和油、7 种植物油的THz 吸收谱，得到它们的特征吸收参数，对它们的特征吸收峰进行分析和对比，最终得出结论，脂类有机大分子在THz波段存在差异性吸收。廉飞宇等[15]采用太赫兹时域光谱研究4 种食用油在0.2～1.6 THz 波段的延时特性和折射率特性，试验表明，相对于色谱法和其它理化检测方法，太赫兹时域光谱法具有非破坏性、简单、安全可靠的特点。Liu 等[16]提出一种基于太赫兹光谱和化学计量工具的理化质量参数，用于转基因棉籽油的非破坏性快速鉴别方法，应用偏最小二乘判别分析建立识别模型并对其进行预测，结果表明，太赫兹光谱可用作鉴定不同的转基因棉籽油及非转基因棉籽油。Liu 等[17]研究使用太赫兹光谱法快速测定大豆油中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的可行性，将太赫兹吸收光谱与反向传播神经网络和t-SNE 预处理方法结合，获得最佳模型，定量预测大豆油中AFB1浓度，并确定AFB1 的检测限。目前已有对太赫兹光谱技术在油脂检测方面的应用研究，而对磷脂酸的分析未见相关报道。

本试验中首先将一级大豆油用硅胶处理，然后向大豆油中添加不同量的磷脂酸制得人工模拟毛油，在室温下对样品进行太赫兹光谱扫描，得到大豆油脂样品的时域谱，通过傅里叶变换和计算得到样品的频域谱和吸收谱。将样品的吸收谱作为输入变量建立偏最小二乘（Partial least squares，PLS）模型，研究其与高效液相色谱法检测的磷脂酸实际含量的偏差，以期实现快速、无损检测大豆油中的磷脂含量，为脱胶过程中大豆毛油残磷量的动态监控分析奠定理论基础。

1 方法

1.1 材料与试剂

一级大豆油，九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；磷脂酸，河南明瑞食品添加剂有限公司；磷脂酸标准品，西格玛化工公司；硅胶（200～300目），武汉市矽利康有机硅材料有限公司；正己烷（色谱纯），天津顺隆达科技公司；异丙醇（色谱纯），天津市化学试剂三厂。以上试剂无特殊说明者均为分析纯。

1.2 主要仪器、设备

Z-1 太赫兹系统，美国Zomega 公司；Waters1525 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；AR2140 电子精密天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；样品池比色皿，江苏晶科光学仪器设备制造厂；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪高科仪器厂；SZ-1 型快速混匀器，江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；101-3-S 型电热鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；恒温水浴振荡器，金坛市顺华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品油的制备 称取200 g 硅胶（200～300目），放入托盘中，在105 ℃的烘箱中活化2 h。称取50 mL 一级大豆油，加入到250 mL 锥形瓶中，再加入6 g 活化硅胶，在55 ℃，转速85 r/min 的恒温水浴振荡器上振摇60 min，均匀吸附、离心后取上清液，添加一定量的磷脂酸，在40 ℃的磁力搅拌器上搅拌均匀，即可制备出大豆毛油样品。重复以上操作，称取不同量磷脂酸（精确到0.0001 g）溶解在经硅胶吸附后的大豆油中，制备出105 份模拟脱胶大豆毛油样品，编成1～105 号，并通过高效液相色谱检测制得的105 个样品中磷脂酸含量，测得其含量分布在0.0541～2.3941 g/50 g，平均值为0.9963 g/50 g，样品范围较适中，且在各个范围内的样品分布个数比较均匀，保证了之后模型预测的准确性。

1.3.2 太赫兹光谱的采集 本研究利用首都师范大学“太赫兹波谱与成像重点实验室”组建的太赫兹时域光谱系统对大豆油脂样品进行光谱采集，THz-TDs 系统的主要组成部件是美国Coherent 公司的Vitesse-800-5 型钛蓝宝石飞秒激光器以及美国Zomega 公司的Z-1 太赫兹系统，以ZnTe 为探测晶体，以钛蓝宝石激光器作为激发光源；平均功率为960 mW，脉宽为100 fs，重复频率在82 MHz，中心波长800 nm。THz 透射装置如图1所示：

图1 THz 光谱系统透射模式光路原理图Fig.1 Schematic diagram of the transmission mode optical path of the THz spectrum system

飞秒激光脉冲在透过分束棱镜后被分为泵浦光（光路Ⅰ）和探测光（光路Ⅱ）两束，泵浦光主要作用是激发太赫兹发射器产生太赫兹脉冲，探测光用于探测太赫兹脉冲和检测太赫兹脉冲的场强[18]。泵浦光经斩波器调制后通过一系列变化产生THz 脉冲，THz 脉冲通过一系列离轴抛物面镜最终被聚焦在被测样品上，然后携带样品一定信息量的太赫兹脉冲与探测光共线并经过ZnTe 晶体[19]。通过线性电光效应，THz 脉冲的电场对ZnTe的折射率椭球进行调制，改变探测脉冲的偏振态，通过检测偏振，获得正比于THz 电场的电信号。在延迟装置的作用下，使探测光能够探测太赫兹脉冲的电场强度，产生的光与探测光之间的光程差发生改变，从而获得时域波形[20]。分别通过测量干燥氮气和大豆油脂样品得到参考信号和样品信号，为减小光谱数据的测量误差，以样本3 次测量的平均值作为最终的光谱值。此外，由于水在太赫兹波段有强烈的吸收，为提高试验精度，需要将水分对试验的影响降到最低，所以检测区域在充满氮气的有机玻璃罩中进行，试验时温度21 ℃，湿度小于4%。

1.4 数据处理

将时域信号进行快速傅里叶变换得到参考信号和大豆油脂样品的频域信号，采用Dorney 等[21]和Duvillaret 等[22]提出的公式计算吸收系数，得到样品的吸收谱。

式中：ω——角频率；d——样本的厚度；c——太赫兹波在空气中的传播系数；所涉及的φ（ω）和ρ（ω）变量为样本的频域信号与参考频域信号作比后的比值函数所得；φ（ω）——比值函数的相位；ρ（ω）——比值函数的幅值。

2 结果与讨论

2.1 太赫兹光谱分析

2.1.1 时域谱分析 采用上述THz-TDS 装置，测量了参考信号（仅充满干燥氮气的样品池）和1～105 号大豆油脂样品的太赫兹时域谱，为增加信噪比，每个样本测量3 次，取其平均值作为测量结果，参考信号及105 个大豆油脂样品的THz 时域谱波形如图2所示，图中黑线为参考信号的时域信号，其它彩色线条是大豆油脂样品的时域信号。

由图2 可知，试验测量中整个测量时间窗口为9 ps，在主峰出现后，参考波形及样品的时域信号波形没有出现若干个副峰，说明试验中测量容器的Fabry-Perot（FP）效应几乎没有，可知FP 效应对本次试验的影响较小[23]。同时可以看出，THz波经过大豆油脂样品时的波形基本一致，没有发生明显的变化。由于大豆油脂样品的折射率大于氮气在太赫兹波段的折射率，THz 波在透过大豆油脂样品后相对于参考信号在时间上均产生了不同程度的延迟[24]。不同磷脂酸含量的大豆油脂样品对THz 波的吸收不同，导致THz 波在大豆油脂样品中的损耗不同，使得波谱的振幅有不同的衰减及展宽。

图2 大豆油样品及参考信号的THz 时域谱Fig.2 THz time-domain spectrum of soybean oil samples and reference signals

2.1.2 频域谱分析 将得到的大豆油脂样品的时域谱进行傅里叶变换得到其频域谱，结果如图3所示，图中用不同颜色的曲线分别表示了参考信号及大豆油脂样品的频域谱。

由图3 可知，参考信号频域谱线比较平滑，说明FP 效应对试验的影响较小，系统的运行环境较好[23]。太赫兹光能量值在0.1～2.6 THz 之间，参考信号和大豆油脂样品的频域谱波形基本相同，差别不大，太赫兹脉冲经过大豆油脂样品后，在该THz 频段，幅值均有不同程度的降低，参考信号的振幅最高[25]，大豆油脂样品的磷脂酸含量越高，其频域谱的幅值越小，对THz 波的吸收强度越大。

图3 油脂样本及参考的THz 频域谱Fig.3 THz frequency domain spectrum of oil sample and reference

2.1.3 吸收谱分析 利用1.4 节中的公式进行计算，得到大豆油脂样品的吸收谱，如图4所示。在105 个大豆油脂样品中随机抽取3 个，进行THz吸收谱波形的比较，3 个样品的THz 吸收谱如图5a、5b所示，其中图5b 为图5a 的局部放大图。

图4 大豆油脂样品的THz 吸收谱Fig.4 THz absorption spectrum of soybean oil samples

图5 随机抽取样品的THz 吸收谱及放大图Fig.5 THz absorption spectra of randomly selected samples and magnification

由图4 可知，样品间的THz 吸收谱信号既有相似性又存在差异。随着频率的增加，大豆油脂样品的吸收系数逐渐增加，且磷脂酸的含量越高，吸收系数越大，说明磷脂酸的存在提高了大豆油脂样品对THz 波的吸收程度，这与Hao 等[26]和Huang 等[27]的研究结果一致。图5a 更加清晰地展现了大豆油脂样品的吸收谱图，在0.4～1.5 THz 大豆油脂样品的吸收谱线几乎平稳，没有明显的吸收峰，而在1.5～2.6 THz 内出现了多个较显著的吸收峰，且由图5b 的局部放大图可以看出，大豆油脂样品在1.58 THz 处都出现了第1 个较为明显的吸收峰，可作为其在太赫兹波段的指纹谱用于特征识别[28]。

2.2 数据处理及模型的建立

2.2.1 异常样品的剔除 样本制作及检测过程中，由于仪器及人为误差的影响，会使得样本中存在一些异常样品，在建模的过程中，会改变数据的整体分布，影响模型预测的准确性，为了提高模型的预测精度，首先将整体样品中的异常样品进行剔除[29]。本试验采用PLS 对105 大豆油脂样品建立PLS 数学模型，结果如图6所示。

图6 105 个样本浓度残差图Fig.6 Residual plot of concentration for 105 samples

试验利用逐一剔除法进行了异常样品的剔除[30]。由图6 可以看出，在105 个大豆油脂样品的预测结果中，64 号样品较其它样品的残差相对较大，属于奇异点，该样品的存在影响了模型的整体预测结果，因此首先将其作为异常样品进行剔除。在剔除64 号异常样品后，将剩余样品进行重新建模，再比较在样品整体分布中误差较大的点，进而将该样品作为奇异点进行剔除。以此类推，每剔除一个或几个奇异点后，均重新进行建模，比较整体样品中是否存在奇异点，直到最后一次建立的模型中，没有误差较大的样品。最终确定了14 个奇异点，逐一剔除后，将剩余的91 个样品进行模型的建立。

2.2.2 样品分集 输入吸光度的频率范围为0.4～2.6 THz，将91 个样品分为两组进行校正和预测，校正集样品性质需能够涵盖未知样品的化学性质，同时校正集样品的浓度变化范围需大于未知样品的浓度变化范围，且化学值分布均匀等条件，预测集用来评估校正集所建立模型的精度[31]。要构建一个可靠的模型，需要使用一半以上的样品进行校正，因此，本试验用73 个样品作为校正集，18 个样本作为预测集，具体的校正集和预测集样品信息统计结果见表1。

表1 校正集和预测集样本信息统计表Table 1 Statistics of sample information of correction set and prediction set

由表1 可知，校正集的73 个样品，磷脂酸含量为0.1417～1.9752 g/50 g，平均值在1.0532 g/50 g，可知校正集样品磷脂酸含量适中，且分布在各个范围内的样品个数比较均匀，保证了校正模型测量的精确度。预测集的18 个样品，磷脂酸含量为0.2356～1.9501 g/50 g，平均值在1.0497 g/50 g，可知预测集样品基本覆盖了91 个大豆油脂样品中较广泛的磷脂酸的含量，可以使预测模型具有较好的准确性和适用性。

2.2.3 基于PLS 模型的建立及预测 剔除奇异点后，采用经典的PLS 法分别对未经处理的原始光谱以及经一阶导数、二阶导数处理后的谱图建立磷脂酸含量的校正及预测模型[32]，结果见表2。

表2 校正模型和预测模型结果Table 2 Alibration model and prediction model results

由表2 可以看出，通过二阶导数预处理后的预测集决定系数R2为0.9980，表明大豆油脂样品中的磷脂酸含量与THz 吸收系数具有较高的相关性，预测集均方根误差RMSEP 为0.0813，相对标准偏差RSD 为8.16%，模型相关系数较大，误差在允许范围内，所建模型稳定性和准确性可靠[33]，经二阶导数处理后的光谱预测模型如图7所示。

由图7 可以看出，样品的数值点比较均匀地分布在直线的两侧，建模效果良好，二阶导数去除了与波长相关的漂移，有效提高了模型的精度，表明经二阶导数预处理后的太赫兹光谱建立的PLS模型适用于定量检测模拟脱胶大豆毛油中磷脂酸含量。

图7 二阶导数光谱预测结果Fig.7 Prediction results of the second derivative spectrum

3 结论

本文制得不同磷脂酸含量的大豆油脂样品，并精确测定了大豆油脂样品中磷脂酸的含量。采集了样品的太赫兹时域谱，利用傅里叶变换将太赫兹时域谱转换为频域谱，然后通过光学参数计算得出太赫兹吸收谱。THz 波产生了不同程度的延迟，样品中磷脂酸的含量越高，频域谱的幅值越低，吸收系数也越大，特征吸收峰明显，可用于大豆油中磷脂酸的特征识别。

利用PLS 对剔除异常样本后的91 个样品建立了磷脂酸含量与样品吸收谱之间的定量分析模型，其中原始光谱和经一阶导数处理后的模型R2较小，RMSEP 和RSD 较大，而经二阶导数预处理后光谱模型的R2较大，RMSEP 较小，RSD 低于10%，表明利用太赫兹光谱可以检测大豆油中的磷脂酸含量，为太赫兹光谱快速分析检测大豆毛油中的残磷量提供理论依据。