不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质的差异性分析

韩金志，潘雯丽，沈 昊，汪少芸

（福州大学生物科学与工程学院 福州350108）

乳酸菌是一类GRAS（Generally Regarded As Safety）级食品微生物，已广泛应用于发酵食品，可发挥抗菌、防腐，赋予食品特殊风味以及提高营养品质等功能[1]。目前，用于生产发酵食品的乳酸菌大概有20 余种，如：保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌用于生产酸奶，德式乳杆菌用于发酵畜产品，干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌用于生产乳酪等[2-4]，植物乳杆菌是酸菜发酵生产中的优势菌株[5]。以上这些传统的乳酸菌发酵食品各自具有独特的风味，深受消费者青睐。

豆浆是一类通常以大豆为原材料制成的传统植物蛋白饮料，在豆浆的基础上经乳酸菌等菌株发酵可制成发酵豆浆。与传统豆浆相比，发酵豆浆中的大豆蛋白能被分解为氨基酸和寡肽，更易于人体的吸收，同时破坏豆浆中的凝血素、胰蛋白酶抑制剂、胀气因子等抗营养因子[6]。此外，经乳酸菌发酵，发酵豆浆被重新赋予新的风味。其中，挥发性香气成分的增加或生成是发酵豆浆提升感官品质的重要因素。固相微萃取技术（SPME）是一种无溶剂样品前处理技术，具有高效、便捷、操作简单等特点，与GC-MS 技术相结合被广泛应用于发酵食品中挥发性气味物质的定性、定量分析[7]。相关研究已有大量报道。樊艳等[8]采用基于电子舌与SPME-GC-MS 技术检测分析了腐乳中的风味物质；王丹等[9]采用SPME-GC-MS 技术分析嗜热链球菌IMAU10638 发酵乳贮藏期间的挥发性风味物质变化；马艳丽等[10]基于SPME-GC-MS 技术比较4 种传统中式酸凝奶酪与西方切达奶酪中挥发性风味组分的差别。基于SPME-GC-MS 技术分析发酵食品中特征性风味物质的组成及产生规律，对传统发酵食品的品质调控和改善具有重要意义。

目前，针对乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质组成和特征香气物质分析的研究较少。本研究选择在发酵食品中应用广泛的5 种乳酸菌：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、德式乳杆菌（Lactobacillus germani）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）生产发酵豆浆，并对不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质的组成与差异性进行分析，旨在为乳酸菌发酵豆浆饮料的开发与生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆浆粉购于永和食品（中国）股份有限公司；纯净水，华润怡宝饮料（中国）有限公司；2-辛醇（分析纯），美国Sigma-Aldrich 公司；植物乳杆菌FZU122、干酪乳杆菌FJAT-7928、德式乳杆菌FJAT-46740、发酵乳杆菌FJAT-46744、嗜热链球菌FJAT-46738，福州大学生物科学与工程学院保藏。

1.2 培养基的配制

MRS 培养基：分别称取牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、磷酸氢钾2 g、无水乙酸钠5 g、硫酸锰0.25 g、柠檬酸氢二铵2 g、吐温-80 1 mL、硫酸镁0.5 g 溶解于1 000 mL蒸馏水中，调pH 值至6.2，121 ℃高压灭菌20 min。

生理盐水：称取8～9 g NaCl 固体，溶解于1 000 mL 去离子水中，121 ℃高压灭菌20 min。

1.3 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（UV-1100 型），上海美普达仪器有限公司；数显pH 计（MP511），上海三信仪表厂；气相色谱质谱联用仪（5977A），美国安捷伦科技有限公司；固相微萃取萃取头，PDMS 30 μm，美国Supelco 公司；SPME 手动进样柄（57330-U），美国Supelco 公司；恒温生化培养箱（SPX-150BIII），黄骅菲斯福实验仪器有限公司；立式高压灭菌锅（LDZF-50L-III），上海申安医疗器械厂；理化分析型超纯水机（WP-UP-LH-20），四川沃特尔水处理设备有限公司；分析电子天平（HZK-FA2105），美国康州HZ 电子科技有限公司；高速冷冻离心机（Fresco 17），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电磁搅拌器（OMS-181E），上海欧河机械设备有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 豆浆的制备 称取一定量豆浆粉，以10%的比例（质量比）溶解于纯净水，充分搅拌均匀，分装至200 mL 丝口瓶，121 ℃高压灭菌20 min，待用。

1.4.2 菌株活化与接种 5 种乳酸菌包括：植物乳杆菌FZU122、干酪乳杆菌FJAT-7928、德式乳杆菌FJAT-46740、发酵乳杆菌FJAT-46744、嗜热链球菌FJAT-46738，由甘油管分别接种至MRS液体培养基37 ℃静置培养，经活化、转接培养后，取一定量菌液离心，去除上清液，用生理盐水洗涤3 次。以生理盐水作参比溶液，将菌液吸光度（OD600nm）调至0.5～0.6。分别以1%的接菌量接种至100 mL 无菌豆浆，每个试验组设立3 个平行样，同时设立未发酵豆浆对照组，置恒温生化培养箱37 ℃条件下静置发酵60 h。

1.4.3 pH 值的测定 MRS 液体培养基和豆浆经不同乳酸菌发酵后，取样，用pH 计测定不同乳酸菌发酵样品的pH 值，每个试验组设3 个平行样。

1.4.4 顶空固相微萃取 取5 mL 样品置12 mL顶空萃取瓶中，加入1 g NaCl、磁力转子和10 μL 2-辛醇（10 mg/L，内标物），用密封垫迅速密封样品瓶，置磁力搅拌器加热台上，搅拌速度600 r/min，40 ℃水浴温育20 min 后插入固相微萃取针，压出萃取纤维，使其固定在距离液面0.5～1.0 cm处，吸附萃取30 min 后收回萃取纤维，拔出萃取针，插入气相色谱-质谱联用仪中进样分析。

1.4.5 气相色谱-质谱联用分析 气相色谱质谱联用分析条件[11]：采用DB-WAX 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃；柱温箱起始温度40 ℃，保留8 min，然后以4 ℃/min 升温至150 ℃，再以20 ℃/min 升温至250 ℃，保留5 min；不分流进样，载气为99.999%高纯度氦气，载气流速1 mL/min。质谱条件：离子源温度230 ℃，电离方式为EI，电离能量70 eV，接口温度250 ℃，四级杆温度150 ℃，选择SCAN 模式为扫描方式，定性分析，离子碎片的扫描范围为30～500m/z，溶剂延迟时间2.5 min。

1.4.6 挥发性成分的定量分析[12]选择匹配度≥70，采用内标法定量分析。将10 μL 质量浓度为10 mg/mL 的2-辛醇和5 mL 待测样品混合均匀，对含有内标物的样品通过GC-MS 进行分析。根据待测样品和内标物的峰面积，计算待测组分在样品中的含量。

1.4.7 数据处理分析 运用SPSS 19.0 统计分析软件处理试验数据，采用STAMP 软件比较组间物质差异，利用Heml 软件绘制热图，应用SIMCA 14.1 软件进行主成分分析，使用Origin 8.5 软件和GraphPad 6 软件绘图。试验数据为3 次测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌在发酵豆浆过程中的产酸能力

乳酸菌在食品发酵过程中，以产生乳酸、苯乳酸、乙酸等有机酸为典型特点，不同乳酸菌在不同的营养条件下的产酸能力亦存在差异性。通常可依据发酵体系中pH 值的变化来判断乳酸菌的生长状态及发酵进程。由图1所示，5 种乳酸菌分别接种至MRS 液态培养基，发酵后，5 个发酵组的pH 值与对照相比均显著下降，而乳酸菌发酵组间无显著性差异，表明5 种乳酸菌在MRS 液体培养基中均可正常生长，且代谢产酸能力相近。然而，5种乳酸菌在豆浆中的发酵产酸能力存在差异。其中，干酪乳杆菌（L.casei）与嗜热链球菌（S.thermophilus）发酵组产酸能力较强，其次是植物乳杆菌（L.plantarum），再次是德氏乳杆菌（L.germani）和发酵乳杆菌（L.fermentum）（见图2）。结果表明，干酪乳杆菌和嗜热链球菌相比其它3 种乳酸菌在豆浆发酵过程中具有更强的发酵产酸能力。豆浆中含有少量棉子糖、水苏糖等低聚糖以及葡萄糖、果糖、蔗糖，可为乳酸菌生长代谢及乳酸发酵提供碳源。此外，部分游离氨基酸在脱氨基作用下可产生丙酮酸、延胡索酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸等中间产物，进入三羧酸循环等代谢途径，亦可为乳酸菌的生长繁殖和发酵产物合成过程提供碳骨架、能量和还原力。干酪乳杆菌和嗜热链球菌通常用于酸奶、干酪等发酵乳制品生产，其细胞内代谢系统经长期演化获得对乳制品营养环境的生物学适应性，由于豆浆与动物乳汁营养素组成相近，因此在豆浆发酵过程中同样表现出较强的发酵产酸能力。

图1 不同乳酸菌MRS 培养基发酵液pH 值Fig.1 pH of MRS midium fermented with different lactic acid bacteria

图2 不同乳酸菌发酵豆浆的pH 值Fig.2 pH of soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

2.2 不同乳酸菌发酵豆浆挥发性成分的定性分析结果

乳酸菌被广泛应用于食品发酵，经代谢过程在食品中产生多种香气物质，赋予发酵食品特殊的风味。采用GC-MS 分析未发酵豆浆和5 种乳酸菌发酵豆浆中的挥发性气味物质，总计检测出47种挥发性气味物质，其中，醛类19.15%、醇类40.43%、酮类12.77%、有机酸类6.38%、酚类6.38%、呋喃类6.38%、脂类等其它物质8.51%。在未发酵组豆浆中检测到26 种挥发性气味物质，以醛类（9 种）、醇类（5 种）、烃类（4 种）和酮类（4）为主。与前人利用顶空固相微萃取技术从豆浆中萃取到23 种挥发性成分：醛类10 种、醇类5 种、酮类3 种、呋喃2 种、酯类1 种、其它类2 种的结果相一致[11]。在乳酸菌发酵豆浆试验组，植物乳杆菌发酵组中检测到40 种挥发性气味物质，干酪乳杆菌发酵组中40 种，德式乳杆菌发酵组中43 种，发酵乳杆菌发酵组中44 种，嗜热链球菌发酵组中40 种。5 种乳酸菌发酵组豆浆与未发酵组相比较醛类物质数量减少，而酚类、酸类、烃类、醇类、酮类物质数量均增加（见图3、表1）。

图3 不同菌种乳酸菌发酵豆浆的挥发性气味物质经GC-MS 检测的总离子流图Fig.3 GC-MS total ion current chromatogram of volatile odorants in soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

表1 各样品中匹配度较高的挥发性物质数量Table 1 The number of volatile substances with high matching in each sample

2.3 不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质定量及差异分析

乳酸菌发酵豆浆过程中糖类、氨基酸、脂肪酸、维生素、醛、酮等物质经代谢转化可产生大量挥发性气味物质，从而赋予发酵豆浆新的风味。由图4所示，未发酵豆浆与5 种乳酸菌发酵豆浆相比，挥发性气味物质的差异变化显著。未发酵豆浆中含有正己醛、苯甲醛、戊醛、壬醛、正辛醛等9 种醛类物质。在这些醛类物质中正己醛、戊醛、壬醛等可产生豆腥味，苯甲醛、2，4-癸二烯醛、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛则对豆浆的特有风味有香气贡献。5 种乳酸菌发酵组中，以上9 种醛类物质均显著下降或部分消失，与前人通过乳酸菌发酵豆浆降低己醛含量，减少豆腥味的研究结果相一致[13]。同时，也解释了发酵豆浆豆腥味消除，并伴随着豆浆原始香气特征减弱的原由。此外，5种乳酸菌发酵豆浆中醇类物质与酮类物质种类及含量显著增多，其中醇类物质中，苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香，正戊醇略带果香，芳樟醇具有铃兰香气，苯甲醇（定香剂，略带香气），正己醇具有水果芬芳香气，正辛醇具有甜香味，1-壬醇稍有玫瑰和橙子香气，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气，这些醇类赋予乳酸菌发酵豆浆鲜香醇厚的特征香气。在新产生或含量增大的酮类物质中，苯乙酮有山楂的气味，2-庚酮有类似梨的水果香味，仲辛酮呈苹果似香气，3-羟基-2-丁酮呈奶油和脂肪的气味，2-壬酮呈水果、花、油脂和药草似香气。新产生的甲基麦芽酚具有焦奶油硬糖的特殊香气。这些物质进一步丰富了发酵豆浆的香气特征。新产生的有机酸，乙酸具有醋酸气味，正戊酸和正己酸具有汗臭味，这些有机酸的产生使发酵豆浆带有发酵酸败的气味（见表2）。乳酸菌发酵豆浆的挥发性气味物质组成与发酵乳制品存在较大差异，发酵乳制品中挥发性的风味物质主要是有机酸、醇类、醛类、酮类、酯类、烃类以及有氧、氮、硫的杂环化合物，如呋喃及其衍生物和噻吩及其衍生物[14]，其中对酸奶的风味贡献度较大的是羧酸类化合物、酮类化合物及醛类化合物，这些风味物质构成了发酵乳的主体风味[15]，如1-壬烯-3-酮[16]、3-甲基丁醛、苯甲醛、正壬醛、双乙酰、乙偶姻和2-壬酮等[17-18]。乳酸菌在豆浆和动物乳汁中因参与风味物质合成相关的代谢途径，可能是导致发酵豆浆和酸奶之间风味物质组成存在差异性的主要原因。

图4 不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质差异分析热图Fig.4 Heat map of the volatile profiles of soybean milks fermented by different LABs

表2 不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质含量Table 2 Volatile odorants of soybean milk fermented with different lactic acid bacteria

（续表2）

2.4 不同乳酸菌发酵豆浆复发性气味物质聚类分析

使用多元数据分析法能清晰地阐明各发酵豆浆样本间的差异。将不同菌种乳酸菌发酵豆浆样品中的所有挥发性气味物质进行多元数据分析，样本聚类树分析见图5。由样本聚类分析树状图（图5a）可见，干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌4 种乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质组成相近，与未发酵豆浆、嗜热链球菌发酵豆浆间均存在差异。

图5 不同乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质聚类分析Fig.5 Cluster analysis of volatile odorants in fermented soybean milk with different lactic acid bacteria

图5b所示，未发酵豆浆的特征化合物是壬醛、正辛醛、戊醛、正己醛、正戊烷、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛；植物乳杆菌、干酪乳杆菌、和德氏乳杆菌发酵豆浆的特征化合物是叶醇、仲辛酮、反-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、3-辛烯-2-酮、（2Z）-2-辛基-1-醇、反式-2-辛烯-1-醇；发酵乳杆菌发酵豆浆的特征化合物是氯甲酸正辛酯、正庚醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、愈创木酚、苯酚；嗜热链球菌两组发酵豆浆中的特征挥发性气味物质是苯酚、芳樟醇、愈创木酚、甲基麦芽酚、2-乙酰基噻唑、2-乙基己醇、异戊醇、正辛醇、苯乙醇、环庚醇、2-壬酮。与文献[19]报道的发酵酸豆奶中的风味物质——丙酮酸、乙酸、苯甲酸等酸类物质含量较高略有差异。

3 结论

本研究结果表明：干酪乳杆菌和嗜热链球菌在豆浆发酵过程中的产酸能力较强。5 种乳酸菌发酵豆浆均显著增加了挥发性气味物质的含量与组成，其中干酪乳杆菌、植物乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌4 种乳酸菌发酵豆浆挥发性气味物质组成相近，与未发酵豆浆、嗜热链球菌发酵豆浆间存在差异。未发酵豆浆的特征挥发性气味物质是壬醛、正辛醛、戊醛、正己醛、正戊烷、反-2-辛烯醛、反，反-2，4-癸二烯醛。植物乳杆菌、干酪乳杆菌和德式乳杆菌发酵豆浆的特征化合物是叶醇、仲辛酮、反-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、3-辛烯-2-酮、（2Z）-2-辛基-1-醇、反式-2-辛烯-1-醇。发酵乳杆菌发酵豆浆的特征化合物是氯甲酸正辛酯、正庚醇、（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、愈创木酚、苯酚。嗜热链球菌发酵豆浆的特征化合物质是苯酚、芳樟醇、愈创木酚、甲基麦芽酚、2-乙酰基噻唑、2-乙基己醇、异戊醇、正辛醇、苯乙醇、环庚醇、2-壬酮。