毛细管电泳分析河蚬汤与巨噬细胞的相互作用

邹坚桥，高观祯，杨多佳，汪惠勤，柯李晶*，彭彰文，周建武，饶平凡，金义光，余兆硕，罗思浩

（1 中国科学院上海生命科学研究院-浙江工商大学食品营养科学联合研究中心 杭州310035 2 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所 北京100850）

毛细管电泳是以毛细管为分离场所，在高压电场的驱动力下，带电粒子依据淌度和分配系数不同而实现快速分离的电泳技术，具有高效、简便、检出限低、灵敏度高等优势。近年来，毛细管电泳广泛应用于基质复杂的食品检测分析，例如Li等[1]采用毛细管区带电泳检测食品中的纳他霉素含量；田春秋等[2]利用毛细管电泳检测牛奶中的青霉素中间体以及3 种青霉素类药物；刘鸣畅等[3]将毛细管电泳用于检测掺假燕窝中银耳成分。基于不同细胞和不同生理活性条件下细胞表面带电性的差异，毛细管电泳是细胞分离分析的有效手段。例如Lu 等[4]利用毛细管电泳鉴别不同动物的红细胞；温桂兰等[5]采用毛细管电泳研究酿酒酵母凋亡细胞。

巨噬细胞是机体内重要的免疫细胞，具有识别、吞噬和清除凋亡细胞及非功能性的胞外成分等功能，其在不同环境和生理条件下有着明显的形态和功能差异[7-9]，常作为评估食品组分对人体作用的试验细胞模型。程安玮等[10]发现甘草多糖能激活巨噬细胞，提高其吞噬能力和能量代谢水平，同时可分泌多种具有杀瘤作用的活性因子；Wang 等[11]研究发现猪骨汤中纳米胶粒与巨噬细胞作用后，被迅速内化，防止活性氧自由基引起的线粒体功能障碍和吞噬抑制；杜华英等[12]认为河蚬糖蛋白通过影响巨噬细胞吞噬能力来发挥免疫活性。李杰萍等[6]利用毛细管电泳定量分析巨噬细胞中5-脂氧合酶信使核糖核酸表达。然而，目前尚未见用毛细管电泳分离巨噬细胞的研究。

河蚬汤具有良好的保肝护肝功效，在煮汤过程中产生大量的自组装活性纳米胶粒[13-15]，纳米胶粒被摄食进入消化道后，首先与包括巨噬细胞在内的黏膜细胞发生相互作用，其效应不明。作者先期研究已建立河蚬汤纳米胶粒的毛细管区带电泳分离分析方法[16]。本文以河蚬汤为例，尝试利用毛细管区带电泳，观测河蚬汤与巨噬细胞作用后汤的多尺度组分与纳米胶粒的变化，以及巨噬细胞相应的表观形貌、表面电荷和功能的变化，以期建立一种简便、快速的研究食品成分-人体相互作用的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将河蚬（台湾花莲立川渔场馈赠）与水按物料比1∶1 煮沸60 min，冷却后纱布过滤，滤过液即为粗制的河蚬汤。

胎牛血清（FBS），购于以色列Biological Industries 公司；0.25%胰酶消化液、青霉素-链霉素混合溶液、DMEM 培养基、D-Hank's 细胞平衡液等细胞培养试剂，购于杭州蒂恩延源科技有限公司；甲醇（色谱纯）、硼酸、硼砂、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、葡萄糖等试剂，购于国药集团化学试剂有限公司；试验用试剂除特别说明外均为分析纯，水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

SD 大鼠（SPF 级，180～200 g）由浙江省医学科学院提供。

1.2 仪器与设备

P/ACE MDQ 毛细管电泳仪及非涂层石英毛细管，购于美国Beckman Coulter 公司；CF16RXⅡ高速冷冻离心机，购于日本Hitachi Koki 公司；1300SeriesⅡ生物安全柜，购于美国Thermo Forma公司；Scepter 2.0 手持式细胞计数器，购于美国Molecular Devices 公司；NU-8500 二氧化碳培养箱，购于美国NUAIRE 公司；DMI3000B 荧光倒置显微镜，购于美国Leica 公司；VCX750 超声破碎仪，购于美国Sonics&Materials 公司；Costar3470培养平板，购于美国Coming 公司。

1.3 方法

1.3.1 河蚬汤、河蚬汤纳米胶粒样品制备 将粗制的河蚬汤经5 000 g 离心10 min 后，得到的上清液即为河蚬汤样品（Clam soup）。取上述河蚬汤置于100 ku 超滤离心管内，4 ℃下5 000 g 离心30 min，超纯水重悬离心3 次，最终截留部分重悬即可得到河蚬汤纳米胶粒（UF-NPs），滤过部分即为河蚬汤超滤滤过液（UF-solution）。3 个样品冻干后置于-30 ℃冰箱中，备用。

1.3.2 原代大鼠巨噬细胞的提取与纯化 将大鼠脱颈处死后，在75%酒精中浸泡3 min，注射DMEM 培养基10 mL 于腹腔内，轻柔大鼠腹部3 min，静置7 min。在无菌条件下剪开大鼠腹腔，小心吸取腹腔液体至离心管中。以2 000 r/min，23℃水平离心5 min，去上清，加10 L 巨噬细胞培养基，转移至25 mm 培养皿后置于37 ℃、5% CO2恒温箱中培养。待巨噬细胞基本贴壁后，用PBS 冲洗2～3 次，再重新加入培养基置于恒温箱中培养，达到纯化巨噬细胞的目的。试验遵照浙江省医学科学院动物护理和使用委员会的标准进行（编号：No.2016R10031）。

1.3.3 巨噬细胞悬浮液制备 用2.5%胰酶消化液消化培养皿中的巨噬细胞，以2 000 r/min，23℃水平离心5 min，去上清，再加入含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L，pH 7.4 的磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，最终通过细胞计数器制备不同细胞浓度的巨噬细胞悬浮液。为了保持活细胞的表面特性，须每次试验前新鲜制备细胞悬液。

1.3.4 巨噬细胞与河蚬汤中组分的相互作用 称取河蚬汤、UF-NPs 和UF-solution 冻干粉，用DHank's 细胞平衡液配置成质量浓度为3，1，2 mg/mL 的溶液，过0.22 μm 无菌过滤膜。将3 种样品加入已贴壁24 h 的巨噬细胞培养皿中，细胞浓度为300×104个/mL，置于培养箱中共孵育。

1.3.5 电泳条件 毛细管在第1 次运行前用甲醇、1 mol/L NaOH、水、运行缓冲液分别冲洗5，30，10，20 min；样品间用0.1 mol/L NaOH、水、运行缓冲液分别冲洗3，5，10 min。

1.3.5.1 河蚬汤、河蚬汤纳米胶粒和河蚬汤超滤滤过液电泳条件[16]非涂层石英毛细管柱62 cm×50 μm，有效长度52 cm；运行缓冲液为0.05 mol/L 硼酸硼砂缓冲液，pH 8.7；分离电压20 kV，压力（0.5 psi）进样10 s，分离柱温25 ℃；紫外检测波长214 nm。

1.3.5.2 巨噬细胞电泳条件 非涂层石英毛细管柱65 cm×150 μm，有效长度58 cm；运行缓冲液为：分离电压15 kV，压力（0.3 psi）进样15 s，分离柱温25 ℃；紫外检测波长280 nm。

2 结果与讨论

2.1 巨噬细胞的毛细管电泳行为

巨噬细胞的缓冲液条件参考Lu 等[4]，选定含4.6%葡萄糖的0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。由于细胞浓度会直接影响巨噬细胞的聚集程度和进样量，从而影响巨噬细胞的毛细管电泳表现。试验配制5 个不同浓度的巨噬细胞悬浮液，分别为5×104，10×104，30×104，60×104，150×104个/mL（依浓度换算进样细胞个数为32，64，191，382，955个），考察巨噬细胞的毛细管电泳行为，结果见图1。

通过对比150×104个/mL 高浓度细胞破碎前后的毛细管电泳图（图1e、1f）可知，正常的巨噬细胞会出现多个紫外吸收峰，而破碎后的巨噬细胞仅在6～7 min 出现了吸收值低且拖尾严重的小峰，这可能是大量的细胞碎片和细胞内容物造成的，故证明毛细管电泳可以有效地区分完整的巨噬细胞和细胞碎片。

从图1a～图1e 可以看出，细胞浓度会影响细胞的迁移时间和出峰个数，其中细胞的迁移时间随着巨噬细胞浓度的增加而延长，范围在7～13 min 之内，这说明巨噬细胞浓度与巨噬细胞的毛细管电泳行为间存在高度响应性。同时，细胞存在迁移时间不稳定、出峰个数易变的特点，分析原因可能是因为细胞聚集导致表面电位改变[17]，不同细胞周期的细胞表面带电性不同[18-19]，细胞与毛细管的吸附等。这一现象说明了高灵敏度的毛细管电泳可以检测到巨噬细胞群体中细微差异，也符合动物组织分离制得的原代细胞往往包含处于不同周期或分化状态的细胞个体。原代分离的巨噬细胞常常同时包含M1 和M2 两种活化类型，毛细管电泳中的多个细胞峰是否对应不同活化类型的细胞，有待进一步研究确认。

图1 不同浓度的巨噬细胞毛细管电泳图Fig.1 Electropherogram of different concentration of macrophages by CE

2.2 巨噬细胞与河蚬汤组分的相互作用

2.2.1 巨噬细胞-河蚬汤混悬液中可溶性成分的变化 河蚬汤中组分与巨噬细胞共同培养2 h后，小心吸取上清液，4 ℃下2 000 r/min 离心10 min，采用毛细管电泳分离分析上清的成分，结果如图2所示。

从图2c 可知，河蚬汤纳米胶粒在毛细管电泳中迁移时间为4.6 min，与前期研究结果一致[16]。采用激光动态光散射仪测得UF-NPs 的平均水合粒径和Zeta 电位分别为（69.6±0.8）nm 和（-13.4±0.6）mV，光散射成像法（Nanosight NS300）测定纳米胶粒数量为（43.2±0.6）×108particles/mL。

比较河蚬汤与巨噬细胞作用前后的电泳图谱，可知河蚬汤与巨噬细胞混悬液中的成分既有原生成分的减少或消失（以数字1、2、3 表示），也生成了一些新成分（以字母A、B、C、D 表示）。河蚬汤及其超滤滤过液中的1、2、3 号物质的紫外吸收峰面积明显减少，其中2 号完全消失，河蚬汤纳米胶粒中的2 号物质也出现了同样的现象，表明巨噬细胞吞噬吸收了河蚬汤中的组分。前期研究已知经分子筛色谱分离的河蚬汤中的大分子组分（蛋白多糖）和小分子组分，在汤的毛细管电泳分离中的泳动时间分别为7.5～9.5 min 和4.3 min[16]；对照图2 可知，1 号组分为河蚬汤的小分子成分，2、3 号组分为汤中的大分子组分。其中，2 号组分在超滤分离的河蚬汤伴生纳米胶粒中也少量存在，其分子质量应该接近超滤截留的分子质量10 ku，又根据河蚬汤纳米胶粒的主要成分为蛋白多糖[15]，汤中很可能存在这类蛋白多糖单体，推测具有紫外吸收且分子质量较大的2 号组分可能是蛋白多糖单体。1 号和3 号组分究竟为何种化合物，尚有待进一步研究。

图2 河蚬汤（a）、河蚬汤超滤滤过液（b）、河蚬汤纳米胶粒（c）与巨噬细胞作用2 h 前后的毛细管电泳图Fig.2 Electropherogram of clam soup（a），UF-solution（b），UF-NPs（c）interact with macrophages before and after 2 h

作用2 h 后的混悬液出现了原本不存在的新物质A、B、C、D，表明在短时间内河蚬汤中组分即可刺激巨噬细胞分泌新的物质，或被细胞降解、代谢产生新的物质。河蚬汤的主成分为蛋白和多糖[15]，可刺激巨噬细胞产生多种细胞因子[20-21]，新物质A、B、C、D 是否为细胞因子尚有待进一步研究。

2.2.2 巨噬细胞-河蚬汤混悬液中纳米胶粒的变化 为了进一步研究巨噬细胞对河蚬汤组分的吞噬情况，用无血清的DMEM 培养基配制质量浓度为1 mg/mL 的河蚬汤纳米胶粒，加入已贴壁24 h的巨噬细胞培养皿中，细胞浓度为300×104个/mL。置于培养箱中分别孵育24 h 和48 h 后，小心吸取上清液置于超滤管中，4 ℃下5 000 g 离心至溶液全部透过，用硼酸硼砂运行缓冲液重悬后，利用毛细管电泳进行检测，结果如表1所示。

表1 与巨噬细胞作用24 h 和48 h 后河蚬汤超滤截留纳米胶粒变化情况Table 1 The modification of UF-NPs with macrophage for 24 h and 48 h

试验结果表明，河蚬汤纳米胶粒与巨噬细胞长时间作用后，峰面积值明显减少。24 h 后峰值减少6%，细胞吞噬纳米胶粒的数量约为8.7×102particles/cell，48 h 后峰面积值减少15%，细胞吞噬纳米胶粒数量约为2.13×103particles/cell。由此可知，48 h 内巨噬细胞对河蚬汤中纳米胶粒有持续性吞噬的作用。Li 等[22]研究发现24 h 内巨噬细胞对不同形态糖纳米胶粒具有持续吞噬现象，其中球形纳米胶粒的内化数量显著高于圆柱形，其内化机制是通过氯氰菊酯和小窝蛋白介导的内吞作用，可为研究巨噬细胞吞噬河蚬汤纳米胶粒的机制提供参考。

2.2.3 河蚬汤纳米胶粒对巨噬细胞电泳行为的影响 将1.3.4 节中河蚬汤纳米胶粒作用2 h 后的巨噬细胞，按1.3.3 节的方法制成20×104个/mL 和150×104个/mL 的细胞悬液，考察河蚬汤纳米胶粒对巨噬细胞电泳行为的影响，如图3所示。

图3 巨噬细胞与河蚬汤纳米胶粒作用2 h 前后的毛细管电泳图谱Fig.3 Electropherogram of macrophages interact with UF-NPs before and after 2 h

从图3 可知，河蚬汤纳米胶粒作用2 h 后的巨噬细胞，与初始状态的巨噬细胞相比，其电泳迁移率加快，迁移时间缩短。细胞在20×104个/mL 低浓度时，出峰时间提前2.42 min；在150×104个/mL高浓度时，巨噬细胞整体的出峰时间提前了2.24 min，具有一致性。细胞电泳淌度是表征细胞表面电荷的参数之一[23]，因此，细胞出峰时间改变的原因可能是巨噬细胞吞噬河蚬汤纳米胶粒后，细胞膜电位发生变化，降低巨噬细胞的表面电荷，减小荷质比而加快其电泳迁移率。

2.2.4 河蚬汤纳米胶粒对巨噬细胞形态学的影响为了考察河蚬汤中组分对巨噬细胞的生长生理状态及形态的影响，将质量浓度为1 mg/mL 无血清DMEM 培养基配制的河蚬汤纳米胶粒溶液，加入已贴壁24 h 的巨噬细胞培养皿中。置于培养箱中分别作用0，0.5，1，2 h 后进行显微镜观察，结果如图4所示。

图4 巨噬细胞与河蚬汤纳米胶粒作用前、后的形态变化（200×）Fig.4 The picture of macrophages' morphological changes at different time interact with UF-NPs（200×）

从图4 可知，加入河蚬汤纳米胶粒0.5，1，2 h后的巨噬细胞，在形态上与加入之前相比出现了显著变化，细胞快速拉长并呈梭状分化，这一现象表明河蚬汤纳米胶粒能快速促进巨噬细胞的分化。巨噬细胞活化为M1 型和M2 型时，膜电位分别表现为增加（去极化）和减少（超极化），巨噬细胞拉长形变常常与M2 型活化有关；而河蚬汤纳米胶粒具有消除自由基的活性，胞内自由基水平的降低可引起细胞膜超极化而降低膜电位，这与上述细胞毛细管电泳迁移率的测定结果相一致。由此推断，巨噬细胞在内化河蚬汤纳米胶粒后，被诱导活化为M2 型巨噬细胞[24-25]，可表现出炎症抑制作用。这一推断尚需进一步用特异性抗体标记等方法来确证。

综上，毛细管区带电泳可用于分析细胞与复杂食品体系中单体组分和纳米级聚集体的相互作用；对比其它常用方法，如流式细胞术、酶联免疫法、荧光染色法等[22]，具有样品前处理简单、分辨率高、快速无损等优势，并可同时测定细胞、食品组分各自在互作后的变化；但单独使用毛细管区带电泳，无法直接鉴定未知成分。

3 结论

本研究发现，原代大鼠巨噬细胞可被毛细管区带电泳分离，操作简单、方便快速、灵敏度高；但存在细胞迁移时间易受细胞浓度影响、出峰个数多、重现性不佳等问题，有待进一步研究解决。同时，毛细管区带电泳可灵敏检测河蚬汤组分与巨噬细胞作用前后的变化，发现巨噬细胞会选择性吸收河蚬汤中可溶性组分，持续内吞汤中的自组装纳米胶粒，发生活化（可能为M2 型）而产生形态学改变，并影响细胞的毛细管电泳行为，同时在细胞上清中可检测到4 种新生成分。

本研究证实毛细管电泳可用于包括溶质与胶体颗粒在内的食品多尺度组分与细胞互作过程的快速分析，表征二者各自的成分和表面荷电性的变化，是研究食品组分-人体相互作用的一种新方法，如与光散射、质谱、特异性荧光标记等检测手段联用，则可以进一步提高方法的准确性，获取更丰富的成分和细胞生理信息。