大粒车前子多糖结构特征对调节小鼠肠道功能的影响

殷军艺，刘晓莹，2，马璐瑶，王 力，邹明悦，聂少平*

（1 食品科学与技术国家重点实验室 南昌大学 南昌330047 2 陕西西凤酒股份有限公司 陕西宝鸡721400）

车前子在我国使用广泛，根据《中国药典》收录，车前子为车前科植物车前（Plantago asiaticaL.）或平车前（Plantago depressaWilld.）的干燥成熟种子，夏、秋二季种子成熟时采收果穗，搓出种子可得[1]，可用于保健食品。车前子中富含多糖，特别富含阿拉伯木聚糖类多糖，具有抗氧化[2]、免疫调节[3-5]、降血压、降血糖和降血脂[6-10]功能。美国FDA 批准使用含车前子可溶性纤维的食品的健康声称，指出它们与冠状动脉心脏疾病的风险降低有关[11]。此外，大量研究显示车前子多糖对肝损伤和生殖系统损伤有缓解作用[12-13]，并且具有良好的提升肠道功能健康作用，包括调节各种消化酶的活性，促进肠道分泌有益的短链脂肪酸和促进有益菌群生长等[14-17]，以及改善结肠炎[18]和便秘症状等[19]，这可能与其黏度特征有很大关系[20-22]。

从结构而言，车前子多糖通常由β-1，4-linked Xylp 连接的木聚糖主链结构，高度分支化，在主链木糖的O-2 或O-3 上分支化，支链上糖残基包括β-1，3-linked Xylp、β-T-linked Xylp、α-1，3-linked Xylp、α-T-linked Araf和α-T-linked GlcAp等[23-29]。车前子中除了阿拉伯糖和木糖外，还含有鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等少量其它类型的单糖。Edwards 等[24]报道卵叶车前子中含有一定量半乳糖、葡萄糖和鼠李糖。Craeyveld 等[30]也证实在卵叶车前子壳中检测出非阿拉伯、木糖成分（包括半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖）。大粒车前子多糖中也含有其它非阿拉伯木聚糖成分[27，29，31]，而有关大粒车前子多糖对肠道健康的积极作用是否与其它类型多糖有关，尚缺乏相关报道。

阿拉伯木聚糖通常对肠道健康有积极作用，而先前报道的车前子多糖免疫调节功能是否与存在的其它类型多糖有关，亟待更多科学数据证实。本文以大粒车前子为研究对象，从中分别制备高黏性阿拉伯木聚糖、低黏性阿拉伯木聚糖以及非阿拉伯木聚糖类多糖组分，利用体内动物试验结合相关肠道健康功能指标分析，明确大粒车前子不同结构类型多糖对调节肠道功能的影响。本研究将为车前子多糖肠道健康功能的深入研究提供理论支持，以期为进一步开发相关肠道保健产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明小鼠，体重18～22 g（级别II，资格证号SCXK（赣）2011-0001），由江西中医药大学提供。

1.2 材料与仪器

材料：大粒车前子（Plantago asiaticalL.）于2014年11月采集自江西省吉安市永和镇，并于2015年7月制备多糖；短链脂肪酸标品：乙酸（100%）、丙酸（100%）、正丁酸（99.9%）、异丁酸（99.9%）、正戊酸（100%）及异戊酸（100%），购于德国Merck 公司、比利时Acros 公司及美国Sigma公司；Ferloyl esterase（rumen microorganise），购于爱尔兰Megazyme 公司；乙醇、苯酚、浓硫酸等均为国产分析纯。

仪器：气相色谱仪，Agilent 6890 N 气相色谱系统，配有FID 检测器及HP-FFAP 柱（19091F-413），美国Agilent 公司；ICS 5000 离子色谱仪，美国Thermo Scientific 公司；ARES-G2 流变仪，美国TA 公司；PHS-3B 精密pH 计，上海雷磁；LABCONCO 冷冻干燥机，美国12 L 立式冷冻干燥机公司；TDL-5-A 离心机，上海飞鸽系列离心厂；手术剪；眼科镊；直尺；注射器等。

1.3 试验方法

1.3.1 车前子多糖的制备 称取经乙醇脱脂后的车前子300 g，以料液比为1∶10 于50 ℃水浴下提取3 h，离心收集沉淀，滤渣重提1 次，合并滤液，浓缩后醇沉（终体积分数为80%）12 h，离心分离，沉淀用无水乙醇洗涤2 次得车前子多糖PLWE。将PLWE 复溶于水中（质量浓度控制在10 mg/mL），离心分离（20 ℃，12 000 r/min，15 min）得上层清液和下层黏稠状物质，分别浓缩、冻干得深褐色固体（PLWE-L）和淡褐色固体（PLWE-H）。

将上述剩余残渣以料液比1∶10 于沸水浴中提取3 h（间断性搅拌），纱布过滤后收集滤液。滤渣重提1 次，合并两次滤液，经浓缩后（多糖质量浓度控制在10 mg/mL）缓慢加入95%乙醇沉淀多糖（体系中乙醇终体积分数为80%），4 ℃下冷藏过夜，离心分离（4 800 r/min，10 min）后收集沉淀得车前子多糖粗多糖，将制得的车前子粗多糖配成约7 mg/mL 的溶液，采用Sevag 法脱蛋白，反复进行3 次至无蛋白层后，再用蒸馏水透析72 h，透析液经浓缩、冻干后得到精制车前子多糖PLCP。

取1 g 精制车前子多糖PLCP 溶于300 mL 0.2 mol/L 磷酸钠缓冲溶液（pH 6.70）中，待其完全溶解后，加入400 μL Ferloyl esterase（rumen microorganise），于40 ℃下磁力搅拌4 h，反应结束后，沸水浴灭酶活15 min，冷却至室温，蒸馏水透析72 h 后经浓缩冻干得到脱除阿魏酸的车前子多糖PLCP-M。

1.3.2 单糖组成分析 参考文献[32]，利用硫酸水解多糖结合离子色谱法测定PLCP 和PLCP-M 单糖组成情况。

1.3.3 小鼠肠道组织指数的测定 将6 周左右的清洁级昆明雄性小鼠，随机分成2 组，每组12 只，并保持饲养小鼠的动物房室温（25.0±0.5）℃和相对湿度（50±5）%，执行12 h/12 h 的灯光/黑暗循环，并且提供足够的饮用水，适应3 d 后开始灌胃。小鼠分组情况：（1）空白组：小鼠经口服灌胃相应剂量的生理盐水；（2）样品组：PLWE-L 组、PLWE-H 组、PLCP 组、PLCP-M 组小鼠经口服相应剂量的车前子多糖；2 组小鼠每天的灌胃量为0.2 g/kg 体重。每天上午9：00，对所有小鼠的体重进行称量，各组小鼠的灌胃量根据当天小鼠体重进行调整，在整个试验周期内，每天观测小鼠的一般健康状况和体重1 次。在灌胃14 d 后，随机处死各组试验小鼠。处死小鼠后，无菌摘除小鼠结肠、盲肠，并立即置于冰冻平板上，清除小鼠结肠周围的脂肪，纵向剪开并将内容物取出，测量结肠长度和质量，所有结肠放置于-80 ℃，待用[33]。结肠指数公式为：

1.3.4 小鼠粪便含水量的测定 分别于灌胃的第0，7，14 天收集小鼠粪便，每2 只小鼠的粪便收集为1 份，每组6 份。测定这3 个灌胃周期的粪便含水量，计算公式为：

1.3.5 小鼠结肠和盲肠内容物中短链脂肪酸及pH 值的影响 准确称取100 mg 各组结肠、盲肠内容物置于圆底密封管中，并置于冰水浴上。按1∶7 的质量比加去离子水稀释，间接性采用涡旋仪混匀，超声5 min，涡旋，再超声5 min，涡旋，然后继续冰水浴静置20 min，在4 ℃下离心20 min（4 800×g），取出上清液至圆底密封管中。重复上述步骤1 次。合并上清液，测定pH 值后，过0.22 μm 水系滤膜，用气相色谱测定其中的短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）。

GC 测试条件：HP-FFAP 柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），载气为N2，流速：1.2 mL/min；色谱柱及进样口温度：240 ℃；升温程序：80 ℃（0.5 min）～150 ℃（4 ℃/min），150～230 ℃（20 ℃/min）；空气流速：300 mL/min；氢气流速：30 mL/min；进样量：1 μL，分流比：1∶10。

1.3.6 试验数据的统计处理 动物试验数据以平均值±标准偏差（±s）的形式表示，采用SPSS 22.0统计学软件进行方差分析，P＜0.05 时认为存在统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 多糖基本结构特征分析

前期已有研究表明[31]车前子多糖PLWE-L 主要中性糖为Rha（21.69%）、Ara（19.10%）、Xyl（43.83%）、Man（1.19%）、Glc（2.13%）和Gal（12.05%），而PLWE-H 主要中性糖为Rha（1.00%）、Ara（20.71%）、Xyl（75.05%）、Glc（1.05%）和Gal（2.19%）。经离子色谱法分析，PLCP 和PLCP-M 为阿拉伯木聚糖类多糖，主要含有的中性糖都为Ara 和Xyl，Ara/Xyl的比例均为0.32。在相同浓度条件下，4 种车前子多糖的表观黏度从大到小依次为PLCP>PLWEH>PLCP-M>PLWE-L。

2.2 肠道器官指数

在整个试验周期内，小鼠生长正常，无便秘或腹泻出现。表1 总结了4 种车前子多糖对小鼠体重、结肠质量、结肠长度及结肠指数的影响。由表可知，整个试验周期内对照组和多糖组小鼠体重无显著性差异产生，经过两周灌胃期后，每只小鼠体重平均增加57%。对照组和4 种车前子多糖灌胃组小鼠的结肠长度和结肠质量无显著性差异，但PLCP 组的结肠指数（1.02）显著高于对照组（0.89，P<0.05）。

表1 4 种车前子多糖对小鼠体重、结肠质量、结肠长度及结肠指数的影响（n=12，±s）Table 1 Effects of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on body weight，colon weight，colon length and index of colon in mice（n=12，±s）

表1 4 种车前子多糖对小鼠体重、结肠质量、结肠长度及结肠指数的影响（n=12，±s）Table 1 Effects of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on body weight，colon weight，colon length and index of colon in mice（n=12，±s）

注：同一行中不同字母之间存在显著性差异（P<0.05）。

组别小鼠体重/g结肠质量/g结肠长度/cm结肠指数/%第7 天第14 天对照34.80±2.92a40.82±3.55a0.35±0.05a9.27±0.82a0.86±0.12a PLCP34.77±3.56a40.97±2.25a0.38±0.05a9.41±0.66a1.02±0.15b PLCP-M35.82±2.07a39.40±3.77a0.38±0.04a9.46±0.66a0.92±0.07ab PLWE-H35.49±2.42a39.49±3.59a0.38±0.05a9.69±0.52a0.91±0.07ab PLWE-L33.21±2.77a40.81±2.62a0.35±0.04a9.33±0.61a0.91±0.12ab

2.3 粪便含水量

测定小鼠在灌胃4 种车前子多糖0，7，14 天的粪便含水量，结果见表2。由表可知，在灌胃之前多糖处理组的小鼠粪便含水量介于55.09%～55.75%之间，此时对照组小鼠粪便含水量为54.77%，两者之间无明显差异存在。这可能是因为灌胃之前所有小鼠均处于同一生长环境且给予相同的饲料膳食。灌胃后，5 组小鼠的粪便含水量开始产生差异，但对照组小鼠的粪便含水量在整个灌胃过程中均无较大变化。相较而言，PLCP 组和PLWEH 组在灌胃7 d 后的粪便含水量（65.70%，65.39%）和灌胃14 d 后的粪便含水量（68.82%，67.38%）显著高于灌胃前的粪便含水量（55.41%，55.22%）（P<0.05）。虽然PLCP-M 组和PLWE-L 组小鼠的粪便含水量在灌胃后略微有所增加，但并无显著性差异产生。

表2 4 种车前子多糖对小鼠粪便含水量的影响（n=6，±s）Table 2 Effects of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on the content of fecal moisture in mice（n=6，±s）

表2 4 种车前子多糖对小鼠粪便含水量的影响（n=6，±s）Table 2 Effects of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on the content of fecal moisture in mice（n=6，±s）

注：同一列中不同字母或者同一行中不同符号之间存在显著性差异（P<0.05）。

组别粪便含水量/%第0 天第7 天第14 天对照54.77±2.49a*56.95±5.04a*56.99±7.02a*PLCP55.41±4.72a*65.70±2.13a#68.82±3.32b#PLCP-M55.09 ±7.63a*64.47±8.05a*66.93±1.44ab*PLWE-L55.75 ±9.56a*64.28±2.89a*64.44±8.91ab*PLWE-H55.22 ±6.31a*65.39±2.18a#67.38±5.75ab#

比较灌胃期小鼠粪便含水量，发现相较于灌胃前，灌胃7 d 后小鼠粪便含水量有较大幅度的增加，到第14 天时，除PLCP 组外（P<0.05），其它组粪便含水量仅有少量增加。以上结果表明4 种车前子多糖的摄入均能增加小鼠粪便含水量，尤其是PLCP 和PLWE-H 这些黏度相对较高的车前子多糖。车前子多糖中存在一些具有强吸水性和高持水性的亲水基团，可使粪便吸水后体积膨胀至原来的几倍，并因此增加粪便质量和松弛度，从而使粪便易于排出[34-35]。结合前期研究结果[31]和有关测定结果，4 种车前子多糖中PLCP 黏度最高，其次为PLWE-H，其高黏性和弱胶性能够增加多糖的持水性和保水性，从而使得粪便吸水膨胀，粪便质量和含水量增加，进一步促进肠道健康[36]。

2.4 结肠内容物中短链脂肪酸及其pH 值

短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸、丙酸和丁酸等是膳食纤维中的复杂碳水化合物经肠道微生物发酵产生的主要代谢物[37]，它在许多方面起着重要作用。乙酸可以在大脑、心脏和周围组织中被氧化利用；丙酸影响肝脏和胆固醇代谢；丁酸作为结肠上皮的能量来源，能够调节上皮细胞和免疫细胞生长与凋亡，进而预防结肠炎和结肠癌的发生[38]。

车前子多糖处理组与对照组小鼠结肠内容物中总SCFA 浓度如图1所示。由图可知，多糖处理组的总SCFA 浓度（7.74～9.37 mmol/L）均高于生理盐水对照组（7.67 mmol/L）。与其它组相比，PLCP组及PLWE-L 组在灌胃后小鼠结肠内总SCFA 显著性增加（P<0.05），分别为9.37 mmol/L 及9.09 mmol/L。相对应的，其结肠内容物pH 值从小到大依次为PLCP 组（6.25）、PLWE -L 组（6.49）、PLWE-H 组（6.64）、PLCP-M 组（6.74）、对照组（6.81）。结肠内容物pH 值的降低可促进结肠健康，原因在于较低的结肠pH 值可抑制有害病原微生物的生长繁殖和降低结肠微生物酶活性[38]，除此之外，降低结肠pH 值还有助于预防结肠癌的产生，对维持肠道健康具有重要意义。

图1 4 种车前子多糖对小鼠结肠内容物中总SCFA 浓度和pH 值的影响Fig.1 Effect of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on total SCFA concentration and pH in colon contents of mice

图2 为车前子多糖处理组与对照组小鼠结肠内容物中各SCFA 浓度情况。由图可知，乙酸、丙酸和正丁酸为结肠内容物中SCFA 的主要组成成分，浓度远高于异丁酸、正戊酸和异戊酸。图2a 显示相较于对照组（4.9 mmol/L），乙酸浓度在灌胃4种车前子多糖后均有所增加，尤其是PLCP-M（6.37 mmol/L）、PLWE-L（6.29 mmol/L）及PLWEH（6.25 mmol/L）（P<0.05），但多糖处理组之间并无显著性差异产生。图2b 表明经灌胃后，PLCP-M组及PLWE-L 组丙酸浓度比其余各组显著性增大（P<0.05）。Mortensen 等[39]研究发现丙酸可以由Glc、Xyl 和Ara 酵解产生。由单糖组成分析结果可知，PLCP-M 中这3 种单糖含量较高，易于丙酸产生。此外，前期研究表明，PLWE-L 中除Ara 和Xyl外，还存在Gal、Glc、Rha 等非阿拉伯木聚糖[31]，其丙酸浓度增加可能与之相关。图2d 中相较于对照组，各多糖处理组在灌胃后结肠内容物中的异丁酸均显著性降低（P<0.05）。正丁酸、正戊酸及异戊酸的浓度在灌胃前后无显著性变化。

图2 4 种车前子多糖对小鼠结肠内容物中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸及异戊酸浓度的影响Fig.2 Effect of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on the concentration of acetic acid，propionic acid，n-butyric acid，i-butyric acid，n-valeric acid，and i-valeric acid in colon contents of mice

2.5 盲肠内容物中短链脂肪酸及其pH 值

车前子多糖处理组与对照组小鼠盲肠内容物中总SCFA 浓度如图3所示。由图可知，与对照组（9.74 mmol/L）相比，除PLCP 组（9.87 mmol/L）以外，PLCP-M 组（13.62 mmol/L）、PLWE-L 组（13.69 mmol/L）和PLWE-H 组（11.42 mmol/L）均显著性增加（P<0.05）。与此对应的各pH 值之间也存在一定差异，其pH 值由小到大依次为PLCP-M 组（6.45）、PLWE-L 组（6.47）、PLWE-H 组（6.71）、PLCP 组（6.94）及对照组（7.08）。相较于其它组，PLCP-M 组和PLWE-L 组的pH 值显著性减小（P<0.05）。

图3 4 种车前子多糖对小鼠盲肠内容物中总SCFA 浓度和pH 值的影响Fig.3 Effect of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on total SCFA concentration and pH in cecum contents of mice

图4 为4 种车前子多糖处理组与对照组小鼠盲肠内容物中各短链脂肪酸浓度情况。由图4a 可知灌胃车前子多糖后，小鼠盲肠内容物中的乙酸浓度均有所增加，PLCP-M 组（7.86 mmol/L）增加幅度最大，与对照组（6.12 mmol/L）存在显著性差异（P<0.05）。对于丙酸浓度，除PLCP 组之外，其余3 组均显著性增加（P<0.05），并且增加的这3 组之间也存在显著性差异（P<0.05）。据报道，丙酸对健康有许多益处，如丙酸能降低小鼠胆固醇水平，且丙酸增加还可减弱肝胆固醇的合成[40]。因此，丙酸水平的增加在一定程度上能够促进肠道健康。丁酸是肠道黏膜的重要能量来源，图4c 显示与对照组（1.56 mmol/L）相比，PLCP-M（3.02 mmol/L）组、PLWE-L 组（4.22 mmol/L）及PLWE-H 组（2.83 mmol/L）在灌胃后正丁酸浓度显著增加（P<0.05），但各组之间异丁酸浓度不存在显著性差异（图5d）。此外，PLWE-H 组的正戊酸和异戊酸浓度水平均显著性增加。

图4 4 种车前子多糖对小鼠盲肠内容物中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸及异戊酸浓度的影响Fig.4 Effect of four kinds of polysaccharides from seeds of Plantago asiatica L.on the concentration of acetic acid，propionic acid，n-butyric acid，i-butyric acid，n-valeric acid，and i-valeric acid in cecum contents of mice

以上研究表明，4 种车前子多糖均具有肠道益生活性，但其活性强弱可能与它们的结构特征、黏度有关。根据前期研究[31，41-42]，车前子中的主要多糖PLCP（以及PLCP-M）、PLWE-H 中主要含Ara 及Xyl，均为阿拉伯木聚糖结构，以β-D-1，4-Xylp残基构成线性主链，分支化程度较高；PLWE-L 中除含有部分Ara、Xyl 外，还存在大量的Rha、Gal 等非阿拉伯木聚糖成分，其结构主要由GalA 与Rha 通过1，4-键或者1，2-键链接构成[31]。PLCP 及PLWE-L 的摄入可显著增加结肠内容中SCFA 的浓度，并且PLWE-L 的摄入也可引起盲肠内容物中SCFA 浓度显著增加。PLCP 中的Xyl 主要存在于主链，支链上含量较少，而PLWEL 中Xyl 主要存在于支链，相较而言支链上的Xyl更易被肠道微生物酵解，从而引起SCFA 浓度的增加。PLCP、PLCP-M 及PLWE-H 均为阿拉伯木聚糖结构，但黏度相差较大，高黏度PLCP 更能够促进粪便含水量增加和结肠中总短链脂肪酸浓度的增加及降低pH 值，这可能是由于黏度高的组分在肠道中蠕动较慢，因此更容易在结肠中发挥作用，同时有利于提高持水力。同时，PLCP-M 和PLWE-L 黏度较低，能够快速通过结肠到达盲肠，更容易在盲肠中发挥相应的作用，包括促进短链脂肪酸产生以及降低pH 值。车前子中非阿拉伯木聚糖组分对于肠道功能的促进作用显示了不同结构特征组分对于肠道益生功能有所不同。

3 结论

本文采用水提醇沉制备4 种车前子多糖PLCP、PLCP-M、PLWE-H 及PLWE-L，PLWE-L不是典型的阿拉伯木聚糖类多糖，PLWE-H、PLCP和PLCP-M 的Ara、Xyl 组成及比例相似，4 种车前子多糖的表观黏度从大到小依次为PLCP>PLWEH>PLCP-M>PLWE-L。进一步采用动物试验对4种车前子多糖的肠道益生功能进行探讨，发现非阿拉伯木聚糖PLWE-L 的摄入可显著增加小鼠结肠内容物和盲肠内容物中SCFA 的浓度，同时增加粪便含水量。高黏度的PLCP 更容易在结肠中发挥作用，包括促进结肠中总短链脂肪酸浓度的增加及降低pH 值，同时有利于提高持水力，而低黏性组分PLCP-M 和PLWE-L 更容易在盲肠中发挥相应的作用。车前子中非阿拉伯木聚糖组分对于肠道功能的促进作用显示了不同结构特征组分对于肠道益生功能存在一定差异性。