CBX4和NET-1在原发性直肠癌中的表达变化及临床意义*

王 凡，王明辉，王建勋，张四新

1.唐山市协和医院普外科，河北唐山 063000;2.唐山市中医医院普外科，河北唐山 063000;3.安国市医院普外科，河北安国 071200;4.解放军陆军第82集团军医院普外科，河北保定 071000

直肠癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，发病率和病死率均居中国恶性肿瘤第5位。据相关研究统计，中国每年新增结直肠癌病例数约37万，其中死亡例数高达19.1万，该病严重危害人们的身体健康[1-2]。因早期直肠癌临床症状不明显，容易导致多数患者未能及时诊治，确诊时往往已发展至中晚期，且易复发，预后差，治疗过程非常痛苦[3]。流行病学调查显示，中国结直肠癌患者5年生存率仅为32%，远低于美国水平(64%)[4]，因而深入探究与结直肠癌发生、发展相关的分子标志物，对疾病的早期确诊、及时治疗和预后改善具有重要价值。染色盒同源物4(CBX4)属于PcG蛋白家族的成员，最初被证实具有E3连接酶活性，参与染色质重组与转录抑制，近来有研究发现，其还与癌症的侵袭与迁移相关[5]，但当前少有研究探讨CBX4与肿瘤的关系。新四极体-1(NET-1)是新发现的一种肿瘤基因，与肿瘤细胞的分裂增殖、浸润迁移有关[6]，而其在直肠癌中的研究很少见。因此，本研究通过测定直肠癌组织中CBX4和NET-1表达水平，分析其与患者临床病理参数及预后的关系，并对二者致癌作用的相关性进行分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取唐山市协和医院在2013年4月至2015年7月收治的行手术切除的原发性直肠癌患者50例，手术过程中留取所有患者癌组织和癌旁正常直肠组织，其中男28例，女22例；年龄37～75岁，平均(55.22±8.14)岁；37～60岁有32例，>60～75岁有18例；吸烟27例，不吸烟23例；饮酒25例，不饮酒25例；TNM分期[7]：Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期34例；淋巴结转移28例，无淋巴结转移22例；分化程度：高、中分化35例，低、无分化15例；肿瘤最大径：≥5 cm 29例，<5 cm 21例；浆膜浸润36例，非浆膜浸润14例。本研究经唐山市协和医院伦理委员会批准。所有患者及其家属均支持本研究，并签署知情同意书。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)经临床病理学诊断并确诊为原发性直肠癌；(2)临床病理资料完整、详细；(3)行该手术前未接受任何针对性治疗。排除标准：(1)合并有其他恶性肿瘤；(2)合并有其他对患者生存期有影响的疾病；(3)病理资料缺失；(4)精神障碍，无法完成术后随访。

1.3仪器与试剂 兔抗人CBX4抗体(生产批号：FNab01331)、兔抗人NET-1抗体(生产批号：FNab05665)、兔抗人二抗(生产批号：FNab00119)均购自武汉菲恩生物科技有限公司；免疫组织化学染色试剂盒(生产批号：YDJ4123)购自上海羽朵生物科技有限公司。生物显微镜(型号：BS200)购自北京佳源兴业科技有限公司；轮转式切片机(型号：SPCC-315)购自东莞市谱标实验器材科技有限公司。

1.4直肠癌组织及癌旁正常直肠组织中CBX4和NET-1水平检测 采用免疫组织化学法测定CBX4和NET-1在原发性直肠癌组织及癌旁正常组织中表达水平，由同一病理科医生独立完成所有病理标本的检测。常规制作相应石蜡标本，约4.0 μm薄片，60 ℃烘干后依次用二甲苯及梯度乙醇脱蜡，3%过氧化氢灭活后修复组织抗原，滴加CBX4或NET-1单克隆抗体孵育过夜，滴加二抗，37 ℃孵育10 min，滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，滴加配制的DAB显色剂进行显色后，用苏木素复染，梯度乙醇常规洗脱脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察拍照。用试剂盒提供的阳性病理切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。实验结果均由1名实验人员和2名专业医师根据评分标准[8]独立判断评定，若结果不同，经讨论后共同决定。着色深度评定：CBX4和NET-1阳性表达为细胞质及细胞膜中出现棕黄色或棕褐色颗粒。阳性表达强度依据阳性着色深度进行评分：样品无染色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。随机选取8个高倍视野(×400)，按照着色细胞相对水平(即所占百分比)评分：<5%记为0分，5%～25%记为1分，>25%～50%记为2分，>50%～75%记为3分，>75%记为4分。根据二者乘积(着色深度评分×着色细胞相对含量)大小评定结果：0～3分为阴性(-)，>3～12分为阳性(+)。其中阴性代表低表达，阳性代表高表达。

1.5病例随访 对所有原发性直肠癌患者进行常规随访，随访时间为0～60个月，平均(38.96±9.75)个月。随访以电话、复查的形式进行，1次/月。随访截止时间为2020年7月31日，死亡患者以死亡日期作为随访截止时间，观察并统计随访时间内患者生存情况。本次研究随访率为100%，所有患者无一缺访。

2 结 果

2.1CBX4和NET-1在原发性直肠癌患者癌组织及癌旁正常直肠组织中CBX4和NET-1阳性表达水平比较 原发性直肠癌患者癌组织中CBX4阳性表达率为74.00%，明显高于癌旁组织的28.00%，差异有统计学意义(P<0.05)；NET-1阳性表达率为68.00%，明显高于癌旁正常组织的24.00%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

注：A为直肠癌组织CBX4阳性；B为直肠癌组织CBX4阴性；C为直肠癌组织NET-1阳性；D为直肠癌组织NET-1阴性；E为癌旁正常直肠组织CBX4阳性；F为癌旁正常直肠组织CBX4阴性；G为癌旁正常直肠组织NET-1阳性；H为癌旁正常直肠组织NET-1阴性。

表1 原发性直肠癌患者癌组织及癌旁正常直肠组织中CBX4和NET-1阳性率比较[n(%)]

2.2CBX4和NET-1表达水平与直肠癌患者临床病理特征的关系 原发性直肠癌组织中的CBX4和NET-1表达水平在不同性别、年龄、吸烟、饮酒及肿瘤最大径的患者之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而在不同TNM分期、不同淋巴结转移情况、不同分化程度、有无浆膜浸润患者之间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 CBX4和NET-1表达水平与直肠癌患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.3直肠癌组织中CBX4和NET-1表达的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，直肠癌组织中CBX4表达水平与NET-1表达水平呈正相关(r=0.647，P<0.05)。

2.4CBX4和NET-1表达情况与原发性直肠癌患者生存率的关系 对50例患者进行为期5年随访，存活16例，死亡34例，总生存率32.00%(16/50)。其中CBX4高表达患者5年生存率[21.62%(8/37)]明显低于CBX4低表达患者5年生存率[61.54%(8/13)]，差异有统计学意义(χ2=7.044，P=0.008)；NET-1高表达患者5年生存率[17.65%(6/34)]明显低于NET-1低表达患者5年生存率[62.50%(10/16)]，差异有统计学意义(χ2=10.059，P=0.002)。见图2。

2.5影响原发性直肠癌患者预后危险因素的Logistic回归分析 以原发性直肠癌患者手术后随访5年的生存结局为因变量(1=存活，0=死亡)，TNM分期、淋巴结转移、分化程度、浆膜浸润及CBX4、NET-1表达水平为自变量，Logistic分析结果显示，TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)、淋巴结转移及CBX4、NET-1高表达都是影响原发性直肠癌患者预后的因素(P<0.05)。见表3。

注：A为CBX4表达情况与原发性直肠癌患者生存率的关系；B为NET-1表达情况与原发性直肠癌患者生存率的关系。

表3 影响原发性直肠癌患者预后危险因素的Logistic回归分析结果

3 讨 论

直肠癌是一种原发于直肠黏膜的恶性肿瘤，属于常见的潜在致死性疾病，该疾病高发人群为40岁以上男性，发病早期症状不明显，随着病情发展，临床主要表现为腹痛、腹部肿块、肠梗阻、低热、乏力等，极大降低了患者的生活质量。临床治疗直肠癌常以手术为主，但因其位置深入盆腔、解剖关系较复杂，致使手术难度增大，术后预后差且易复发，生存率低[9-10]。因此，临床上寻找能有效预测直肠癌患者预后的指标尤为重要，以便对患者提前干预，进而改善预后，降低癌症复发，延长生存期，提高生存率。

PcG蛋白是一类在调节细胞周期、DNA修复及细胞分化、衰老、死亡中具有重要作用的蛋白，在哺乳动物中主要由PcG蛋白复合体1(PRC1)和PRC2组成[11-13]。CBX4属于PRC1核心成员之一，可通过增强低氧诱导血管内皮生长因子的表达和促进血管的生成，增加原发性肝细胞癌的侵袭和转移[14]。陈鹏等[15]在研究microRNA-195通过抑制CBX4在肝癌中的作用时发现，CBX4在肝癌中的过度表达可恢复癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，促进肿瘤的生长。上述结果均提示，CBX4在原发性肝细胞癌中表达水平升高。宋秀道等[16]研究发现，CBX4与肝癌患者组织学分级、肿瘤转移分期、微血管密度、远处转移及血行转移有关，且是影响肝癌患者预后的独立因素，提示CBX4有可能成为判断肿瘤患者预后的分子标志物。NET-1与肿瘤的表达有关，属于四聚体超家族的成员之一，其广泛参与多种恶性肿瘤的发生、发展。有研究表明，NET-1在多种恶性肿瘤中(如胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等)表达水平明显升高[17-19]。杨永江等[20]探讨了NET-1在结肠癌中的表达水平、临床意义和预后分析，结果显示，NET-1蛋白在结肠癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常组织，且其与肿瘤的TNM 分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移等病理参数密切相关；NET-1阳性组的中位生存时间明显短于阴性组，并且其表达水平与结肠癌患者的预后相关，以上结果提示NET-1的异常表达在结肠癌病变的发生、发展中具有重要作用，并与患者的生存期有关，是结肠癌潜在的生物学指标。

本研究中原发性直肠癌组织中CBX4和NET-1阳性表达率均明显高于癌旁组织(74.00%、68.00%vs.28.00%、24.00%)，说明在直肠癌组织中CBX4和NET-1表达上调，同郭飞等[4]结果显示NET-1在直肠癌中呈高表达相一致，提示二者与原发性直肠癌有关。研究进一步分析发现，原发性直肠癌组织中的CBX4和NET-1表达水平在不同性别、年龄、不同吸烟、饮酒情况及不同肿瘤最大径的患者之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，而在不同TNM分期、不同淋巴结转移情况、不同分化程度、不同浆膜浸润情况患者之间，差异有统计学意义(P<0.05)。提示CBX4和NET-1二者可能通过某种作用机制参与原发性直肠癌的发生、发展进程，但针对其具体机制仍有待后期深入探究，进而为临床诊治予以科学依据支持。相关性分析显示，CBX4和NET-1表达水平在直肠癌组织中呈正相关，也推测二者可能在疾病中具有协同作用，影响淋巴结转移或肿瘤细胞增殖、迁移等，因此也提示临床可将二者联合检测，提高诊治准确性；另外，术后随访发现，CBX4和NET-1高表达直肠癌患者5年生存率均明显低于CBX4和NET-1低表达患者，提示二者呈高表达患者预后差，2项指标可能成为评价患者预后的有效指标。Logistic分析显示，TNM分期、淋巴结转移及CBX4、NET-1高表达都是影响直肠癌患者预后的因素，提示CBX4和NET-1高表达患者应进行定期检查，及时发现、治疗，降低预后不良的风险。本研究也受随访时间、样本量少等因素限制，选取病例时间较早，结果存在一定不足，仍需大样本、前瞻性研究进一步验证结果。

综上所述，CBX4和NET-1在直肠癌组织中阳性表达率明显升高，与患者TNM分期、淋巴结转移、分化程度、浆膜浸润有关，且二者呈正相关，与生存率相关，影响患者预后，可能作为评价直肠癌患者预后的临床指标。