Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的表达及相关性*

李 伟，李宏伟，黄 勇，牛晓东，李凤玉

中国人民解放军陆军第81集团军医院:1.病理科;2.肿瘤科，河北张家口 075000

乳腺恶性叶状肿瘤作为一种发病率极低的乳腺肿瘤疾病，分属于乳腺分叶状肿瘤，多发于中年女性患者，具有较高的生存率，但复发率较高[1-2]。乳腺恶性叶状肿瘤临床症状为单侧无痛硬质包块，多数患者发病快，发病数周内即可确诊，少数患者肿瘤生长期漫长，可达多年[3]。干细胞蛋白Piwil样蛋白2(Piwil2)属于Piwi亚家族成员之一，在干细胞发育、自我更新、RNA转录调控机制及诱导沉默中具有重要意义[4]。Piwil2可通过抑制细胞凋亡促进癌症的发生[5]，已有研究表明，Piwil2在乳腺癌组织中异常高表达[6]。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)是一种抗凋亡蛋白，在线粒体外膜通过控制线粒体膜的通透性调节细胞生理活动，除此之外，其在肿瘤的侵袭和转移中起重要的作用[7]。已有研究表明，Bcl-2在结直肠癌组织中呈异常高表达状态[8]。目前，关于Piwil2和Bcl-2与乳腺恶性叶状肿瘤相关性的研究相对较少，因此本研究通过检测Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤患者肿瘤组织中的表达情况，对二者与乳腺恶性叶状肿瘤疾病的相关性进行分析，以期为疾病的检测及术后复发情况提供研究依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010年9月至2015年10月中国人民解放军第81集团军医院确诊的30例乳腺恶性叶状肿瘤患者作为乳腺恶性叶状肿瘤组，平均年龄(41.31±13.54)岁；月经15例，无月经15例；年龄≥45岁有17例，年龄<45岁有13例；肿瘤最大径<5 cm有10例，肿瘤最大径≥5 cm有20例；有淋巴结转移18例，无淋巴结转移12例；肿瘤部位：左乳16例，右乳14例。30例患者肿瘤均原发于乳腺，为无痛性包块且病程多为2周至3年。另选取同期32例乳腺纤维腺瘤患者作为对照组，平均年龄(42.65±12.11)岁；月经15例，无月经17例；年龄≥45岁有16例，<45岁有16例；肿瘤最大径<5 cm有12例，肿瘤最大径≥5 cm有20例；肿瘤部位：左乳17例，右乳15例。本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者和家属均知情并签署同意书。

乳腺恶性叶状肿瘤诊断标准参照《WHO乳腺肿瘤分类》[9]中的相关内容：核分裂象≥10HPF，组织细胞异质性明显，浸润性边界，出现恶性异源性成分，间质过度增生。纳入标准：(1)经活检等手段检查确诊，临床资料完整；(2)进行手术切除治疗，术前未进行其他辅助性治疗。排除标准：(1)在近期进行过化疗或手术等治疗；(2)患其他恶性肿瘤及免疫系统疾病；(3)未经明确病理诊断确诊；(4)临床资料不完整。

1.2仪器及试剂 兔抗人Piwil2多克隆抗体(批号：PAB27177)购自武汉艾美捷科技有限公司；Bcl-2多克隆抗体(批号：PAB8567)购自上海群己生物科技有限公司；即用型SP免疫组化试剂盒(批号：CDJ-1593C-SJH)购自武汉纯度生物科技有限公司；显微镜(型号：CI-POL)购自日本尼康公司。

1.3研究方法

1.3.1标本采集 对照组术中取乳腺纤维腺瘤组织，乳腺恶性叶状肿瘤组患者取手术切除肿瘤组织作为标本。生理盐水清理各组织标本，甲醛固定后进行石蜡包埋、切片(5 μm)。

1.3.2免疫组化法检测Piwil2、Bcl-2表达 将上述石蜡切片使用二甲苯进行脱蜡、水化后采用磷酸盐缓冲盐溶液冲洗5 min。根据试剂盒说明书采用SP法染色，再用苏木精复染、重新水化后封片进行观察。

结果判定如下[10]，根据染色强度：未染色记为0分，弱阳性染色记为1分，中等阳性染色记为2分，强阳性染色记为3分；根据阳性细胞占比：阳性细胞占比≤25%为0分，25%<阳性细胞占比≤50%为1分，50%<阳性细胞占比≤75%为2分，阳性细胞占比>75%为3分。两项评分乘积即染色指数(SI)：阴性(-)，SI≤1；弱阳性(+)，1

1.4随访 对出院患者进行为期5年的随访，截止时间为患者复发时间或至2020年10月，以电话或复查形式记录患者术后复发情况。

1.5统计学处理 使用SPSS 20.0软件进行统计分析，计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman分析Piwil2和Bcl-2表达的相关性；采用COX回归分析影响乳腺恶性叶状肿瘤术后复发的因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1Piwil2、Bcl-2在对照组和乳腺恶性叶状肿瘤组组织中的表达情况 Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤组中的阳性率均明显高于对照组(P<0.05)。见表1、2。

表1 Piwil2在对照组和乳腺恶性叶状肿瘤组组织中的表达情况[n或n(%)]

表2 Bcl-2在对照组和乳腺恶性叶状肿瘤组组织中的表达情况[n或(%)]

2.2乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2表达的相关性 在30例乳腺恶性叶状肿瘤患者中，有17例患者Piwil2、Bcl-2均为阳性表达，有8例患者均为阴性表达；有3例患者Piwil2呈阳性表达而Bcl-2呈阴性表达，有2例患者Bcl-2呈阳性表达而Piwil2呈阴性表达。结果显示，乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2的表达有一定关系(P<0.05)。见表3。

表3 乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2表达的相关性(n)

2.3Piwil2、Bcl-2表达情况与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理参数的关系 乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2的表达在不同月经情况、不同年龄、肿瘤最大径、肿瘤部位患者之间差异无统计学意义(P>0.05)；有淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤患者组织中Piwil2、Bcl-2阳性率分别高于无淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤患者组织(P<0.05)。见表4。

表4 Piwil2、Bcl-2表达情况与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理参数的关系[n(%)]

2.4乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2表达与患者术后复发的关系 经过5年随访后，30例乳腺恶性叶状肿瘤患者中有8例复发，复发率为26.67%。Piwil2阴性患者和阳性患者复发率分别为0.00%(0/10)、40.00%(8/20)，差异有统计学意义(χ2=4.138，P=0.042)；Bcl-2阴性患者和阳性患者复发率分别为0.00%(0/11)、42.11%(8/19)，差异有统计学意义(χ2=4.346，P=0.037)。

2.5COX回归分析影响乳腺恶性叶状肿瘤术后复发的因素 单因素分析发现，淋巴结转移、Piwil2和Bcl-2阳性表达均对乳腺恶性叶状肿瘤的术后复发存在影响(P<0.05)。多因素分析发现，淋巴结转移、Piwil2阳性表达和Bcl-2阳性表达均是影响患者术后复发的独立危险因素(P<0.05)。见表5。

续表4 Piwil2、Bcl-2与乳腺恶性叶状肿瘤临床病理参数的关系[n(%)]

表5 COX回归分析影响乳腺恶性叶状肿瘤术后复发的因素

3 讨 论

乳腺恶性叶状肿瘤是一种极为少见的恶性肿瘤，其起源于小叶内或导管周围间质，仅占原发性乳腺肿瘤的0.9%，而复发率约为30%[11-12]。乳腺恶性叶状肿瘤的发生机制至今尚未研究清楚，其病理特征常表现为组织细胞异质性明显、浸润性边界、出现恶性异源性成分、间质过度增生，常出现肺部转移情况[13-14]。虽然乳腺恶性叶状肿瘤发病率较低，但其造成的死亡多发生在确诊后5年内，而且其复发仍是临床一大难题，因此严重威胁人们的生命健康和生活质量。本研究通过检测Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤患者肿瘤组织中的表达情况，对二者与乳腺恶性叶状肿瘤疾病的相关性进行分析，以期为疾病检测、临床特征分析及预后复发等情况提供信息依据。

Piwi家族在多种生物中表现高度保守，并且在多种人类癌症中异常表达，与肿瘤的发生和预后相关，Piwil2则属于Piwi亚家族成员之一[15-16]。有研究表明，piR-932/Piwil2免疫共沉淀复合物的增加通过降低血小板生成素的表达，促进乳腺癌细胞上皮-间质转化[17]。Piwil2过表达激活内源性RNA，增强信号转导和转录活化因子3(STAT3)/B淋巴细胞瘤-xL(Bcl-xL)、STAT3/CynlinD1信号通路，从而参与肿瘤的发生。研究发现，Piwil2在乳腺癌组织中阳性率明显高于癌旁组织，说明Piwil2可能调控乳腺癌的发生发展机制[6]。本研究结果表明，Piwil2在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的阳性率明显高于乳腺纤维腺瘤组织，与上述结果相一致，这表明Piwil2可能通过调节肿瘤相关信号通路参与乳腺恶性叶状肿瘤的发生过程。

有报道称，Bcl-2可通过延长肿瘤细胞生存期达到抑制其凋亡的作用，从而参与肿瘤的发生、发展[18-19]。还有研究表明，Bcl-2通过增强上皮间质中碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Twist1)在转化中的作用从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移[20]。Bcl-2已被报道在多种癌组织中异常高表达[21]，肖晓岚等[22]研究发现，Bcl-2在乳腺叶状肿瘤组织中表达明显增加，并随肿瘤的恶性程度增加而明显增加。本研究结果发现，Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的阳性率明显高于乳腺纤维腺瘤组织，这表明Bcl-2可能通过抑制细胞凋亡参与乳腺恶性叶状肿瘤的发生过程。还有研究报道称，Piwil2通过上调STAT3和Bcl-2基因表达，促进细胞周期从G0/G1到S期的转变及核因子-κB(NF-κB)的表达来促进肿瘤的增殖[5]。本研究结果也发现，乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2的表达存在一定关系，表明Piwil2、Bcl-2可能通过相互作用共同促进乳腺恶性叶状肿瘤的发生。

除此之外，本研究还发现有淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤组织中Piwil2、Bcl-2阳性率分别高于无淋巴结转移的乳腺恶性叶状肿瘤组织，且二者阳性表达会导致患者术后复发率升高。多因素分析发现，淋巴结转移、Piwil2阳性表达和Bcl-2阳性表达均是影响乳腺恶性叶状肿瘤术后复发的独立危险因素。提示，Piwil2、Bcl-2可作为乳腺恶性叶状肿瘤临床监测和预后复发情况的检测指标。

综上所述，Piwil2、Bcl-2在乳腺恶性叶状肿瘤组织中的阳性率明显增加，并且淋巴结转移、Piwil2阳性表达和Bcl-2阳性表达均是影响患者术后复发的独立危险因素。本研究为乳腺恶性叶状肿瘤发生机制的研究提供了依据，Piwil2、Bcl-2有作为乳腺恶性叶状肿瘤临床预后检测指标的潜能。