软坚散结方对肾透明细胞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

高 宇，王 栋，刘丽坤，王晞星

（山西省中医院，山西省中医药研究院，山西 太原030012）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是恶性度高且致命的泌尿系恶性肿瘤，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，全球每年新增病例约33.8万例，死亡有14.24万人［1］。局限性RCC的5年存活率为65%，而转移性RCC 5年存活率降至10%～20%［2］，目前我国大部分RCC患者病理类型为肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC），占比70%～75%［3］。手术切除是其根治的唯一手段，但术后复发率达50%［4］，靶向及免疫治疗等药物目前在临床广泛使用，有效率较高，但因药品昂贵患者经济负担重，药物不良反应较大，易产生耐药，这些问题都严重影响了患者的临床疗效及生活质量［5］。而中医药治疗肾癌具有多靶点抑瘤、增效减毒、提高患者生存质量、延长生存期等优势。肾癌归属于中医学“尿血”“肾积”“腰痛”等病范畴，前期研究认为痰瘀毒互结是肾癌发生发展的关键因素，活血解毒、软坚散结法为肾癌治疗的重要法则［6］，软坚散结方为肾癌有效临床治疗药物。

Notch信号在肾脏发育中起关键作用［7］，Notch1过表达诱导肾小管上皮细胞异常增殖［8］，异常Notch表达可能直接导致肿瘤的发生。在ccRCC组织样本中，发现Notch通路被广泛激活［8］，但Notch信号对ccRCC的具体作用尚不明确。课题组既往研究已证实软坚散结方可在体外抑制7860细胞增殖，诱导凋亡［9］。本研究拟通过建立裸鼠ccRCC移植瘤模型，观察软坚散结方对肾透明细胞癌荷瘤裸鼠的体内抑瘤作用，检测瘤体组织中Notch信号通路及相关凋亡蛋白、基因的表达，探究软坚散结方抗ccRCC的作用靶点及机制，为开发低毒高效的抗肾癌药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及细胞株4~6周龄SPF级BALB/c雄性裸鼠15只，体质量（20±2）g，购于北京维通利华，合格证号：SCXK（京）2019-0009。人肾透明细胞癌7860细胞株购于中科院上海生命科学院细胞库。

1.1.2 药物与试剂 软坚散结胶囊（山西省中医院内部制剂，药物组成：猫爪草、山慈菇、莪术、枸橘、夏枯草、浙贝母、壁虎、鸡内金、醋山甲、牡蛎，批号：AZ20090347）；Notch通路抑制剂DAPT（5 mg/支，Med Chem Express，批号：GSI-IX）；RPMI1640培养液（Corning公司，批号：05118006）、胎牛血清（Gibco公司，批号：10270106）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，批号：SH30042.01B）、链霉素青霉素双抗（杭州四季青公司，批号：2018050052）、PBS缓冲溶液（Hyclone公司，批号：NZG1189）；一抗兔抗人Notch1（CST，20 μL，批号：VAL1744）、一抗兔抗人NICD（Millipore，100 μL，批号：07-1232）、一抗兔抗人Bax（Abcam公司，10 μL，批号：ab32503）、一抗鼠抗人Bcl-2（Abcam公司，10 μL，批号：ab196495）、二抗（Abcam公司，批号：AR1017）、苏木素-伊红（HE）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0105S）、DAB显色液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0203）、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：AR0102）；Notch1、Bax、Bcl-2引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；免疫组化试剂盒（批号：18001）、RNA抽提试剂盒（批号：B0004DP），购自南京Biomiga公司。

1.1.3 实验仪器 恒温细胞培养箱（美国赛默飞世尔科技公司，型号：Cytoperm 2），低温台式离心机（美国Thermo公司，型号：H1650-W/H1650W）；倒置荧光生物显微镜（日本奥林巴斯公司，型号：CX23）；实时荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号：7900）；石蜡包埋机（德国Leica公司，型号：EG 1150H）；Excelsior全自动全封闭脱水机（德国Leica公司，型号：TP 1020）；F325旋转石蜡切片机（德国Leica公司，型号：EG 1150C）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模 参照文献［1］，裸鼠腋下皮肤接种对数生长期7860细胞悬液，0.1 mL/只（1×108个/mL），隔日观察肿瘤生长情况及小鼠一般情况。

1.2.2 分组与给药 选择15只BALB/c裸鼠，适应环境7 d后，随机编号，分为模型组、软坚散结方组、DAPT组3组，每组5只。参照《中药药理研究方法学》［11］换算裸鼠等效剂量为成人临床用量的15倍，以此设定软坚散结方组给药剂量为46.8 g/kg，予灌胃给药，3 d停1 d，DAPT组按5 mg/kg配DMSO-PBS溶液腹腔注射，模型组予等量的DMSO-PBS腹腔注射，各组腹腔给药，1次/4 d。

1.2.3 计算瘤体积及抑瘤率 给药干预4周后，处死裸鼠，剥离肿瘤组织，滤纸吸干血水后称重，并按公式计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-实验组平均瘤重/模型组平均瘤重）×100%。

1.2.4 HE染色观察肿瘤组织形态 剥取的瘤体经4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色、封片后在光学显微镜下观察，并拍照保存。

1.2.5 免疫组化检测Notch1、NICD、Bcl2、Bax蛋白的表达 石蜡切片常规脱蜡、水化，置0.05 M柠檬酸缓冲液中微波加热（95℃10 min）激活抗原；0.3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育20 min以阻断内源性过氧化物酶活性，加入一抗4℃过夜孵育；加二抗，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明，中性树脂封片，镜检；同时用PBS代替一抗染色作阴性对照。染色的切片在显微镜下有棕黄色颗粒沉着，从每张免疫组化染色切片中随机选取5个视野，输入病理图像分析系统。按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面进行评分。①阳性细胞百分比：无阳性细胞＝0；阳性细胞占1%～10%＝1；阳性细胞占11%～50%＝2；阳性细胞占51%～80%＝3；阳性细胞占81%～100%＝4。②阳性细胞染色强弱：阴性＝0；弱阳性＝1；中度阳性＝2；强阳性＝3。①②两项乘积为该样本的IHS。IHS分级：0分为（－）；1～4分为（＋）；5～8分为（＋＋）；9～12分为（＋＋＋）。

1.2.6 RT-PCR检测Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表达 用TrIzol提取各组组织样本总RNA，琼脂糖凝胶电泳分离，逆转录合成cDNA反应模板，按各基因引物设计PCR扩增，检测Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表达水平。引物均采用Primer网站设计，Notch引物序列：F：5′-GTGCTGGAAGTATTTTAGCGAC-3′，R：5′-GTCCTTGCAGTACTGGTCATAC-3′，Bcl-2引物序列：F：5′-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3′，R：5′-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3′，Bax引物序列：F：5′-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3′，R：5′-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC-3′。

1.3 统计学方法

运用SPSS 21.0软件和GraphPad Prism7软件对数据进行处理和分析进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差（ANVOA）分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组裸鼠一般状况及肿瘤生长情况比较

7860细胞接种后约5 d，皮下可见绿豆大小结节，质韧，活动度差，与皮下组织粘连，后期逐渐突出体表，形状不规则，部分瘤体出现破溃，成瘤率100%。实验期间，各组裸鼠体质量逐渐增加，组间比较差异无统计学意义。模型组和DAPT组后期随着肿瘤增大饮食及活动明显减少，软坚散结方组食水及活动基本正常。软坚散结方组和DAPT组均对裸鼠皮下移植瘤的生长有抑制作用，与模型组比较，平均瘤体积明显减小，瘤质量明显降低（P＜0.05）。软坚散结方组、DAPT组抑瘤率分别为46.26%和24.83%。结果见表1，图1。

表1 各组体质量、瘤体积、瘤体质量比较

图1 各组裸鼠及移植瘤生长情况

2.2 各组瘤体组织病理学表现

模型组见癌细胞生长旺盛，体积较大且排列紊乱，形态不一，呈立方形、楔形、片状等；胞浆呈透明状；细胞核大且深染，呈圆形、卵圆形或怪异型；间质有丰富的毛细血管。软坚散结方组、DAPT组凋亡细胞增多，可见凋亡细胞与邻近细胞分离，细胞核浓缩甚至消失，胞质呈明显嗜酸性，凋亡小体可见。结果见图2。

图2 各组裸鼠瘤体组织形态学表现（HE，×200）

2.3 免疫组化检测各组Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表达

在7860细胞移植瘤中，Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白阳性表达呈棕黄色或黄色着色，其中Notch-1、Bcl-2、Bax阳性表达为胞质染色，而NICD表达主要位于细胞胞核，各组阳性细胞百分率和显色强度均有差异性（图3）。与模型组比较，软坚散结方组、DAPT组Notch1、NICD、Bcl-2蛋白阳性表达明显减少（P<0.05），Bax蛋白阳性率明显增高（P<0.05）。与DAPT组相比，软坚散结方组NICD、Bcl-2阳性率明显下降，Bax阳性率明显增高（P<0.05）。结果见表2。

图3 各组裸鼠瘤体组织Notch1，NICD，Bax、Bcl-2蛋白表达的影响（×40）

表2 各组瘤体组织中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表达 ±s（）

表2 各组瘤体组织中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表达 ±s（）

注：与模型组比较，1）P＜0.05；与DAPT组比较，2）P＜0.05

组别 Notch1 NICD Bcl-2 Bax模型组 3.45±0.38 3.26±0.34 4.67±0.67 1.33±0.33 DAPT组 1.4±0.171）1.79±0.321）2.33±0.331）1.67±0.341）软坚散结方组1.04±0.231）1.13±0.231）2）0.33±0.341）2）8.00±1.001）2）

2.4 各组Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表达情况

7860裸鼠移植瘤组织各基因表达情况，与模型组相比，DAPT组、软坚散结方组Notch1、Bcl-2表达显著降低（P＜0.05），Bax表达显著升高（P＜0.05）；与DAPT组比较，软坚散结方组Notch1 mRNA表达无明显差异；Bcl-2、Bax mRNA表达差异显著。结果见图4。

图4 各组裸鼠Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表达

3 讨论

中药是肿瘤治疗重要手段之一，临床疗效确切，特别是在减毒增效，预防复发转移，防治并发症，逆转多药耐药等方面发挥了关键作用，中药复方抗肿瘤的机制也成为学术界研究热点。恶性肿瘤属中医癥瘕、积聚范畴，痰瘀毒互结是其发生发展的主要病机。软坚散结法属于八法之一的消法，广泛应用于临床肿瘤的治疗，疗效确切［12］。黄洋等［13］研究表明，软坚扶正汤联合DP化疗方案（多西他赛联合顺铂），可有效改善患者临床症状，并提高临床疗效。基础研究表明，龙葵提取物龙葵多糖可通过调控Caspase-3和Bcl-2抑制荷瘤小鼠肿瘤生长［14］；夏枯草通过调控激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、核因子（nuclear factor κB，NF-κB）、P38、血管内皮生长因子（vascular endothelical grouth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶9（matrix metallo proteinase 9，MMP-9）等信号转导抑制肝细胞癌转移［15］。白花蛇舌草乙醇提取物能够通过阻断丝/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase，Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated mprotein kinase，MAPK）、转 录 激 活 因 子3（transcription activator 3，STAT3）等信号通路诱导大肠癌细胞凋亡，抑制细胞增殖［16］。山西省中医院制剂软坚散结胶囊，由猫爪草、山慈菇、莪术、夏枯草、浙贝母等药物组成，本研究证明，软坚散结方对肾透明细胞癌荷瘤鼠移植瘤具有明显的生长抑制作用，且荷瘤鼠对软坚散结方具有良好的耐受性，未见明显不适及不良反应，能下调抗凋亡因子Bcl-2，上调促凋亡因子Bax蛋白及基因的表达，进一步明确软坚散结方通过凋亡途径抑制肾透明细胞癌生长。

Notch信号通路具有调节细胞增殖、分化和凋亡等作用，Notch缺乏或减少会导致肾脏发育异常并直接影响肾脏疾病的发生、发展及转归。Notch通路与肿瘤的发生发展关系密切，已有研究表明，它是T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）和头颈癌的致癌途径［17-19］。Notch信号独立于VHL/HIF通路，在肾细胞癌中发挥着重要作用［20］，组织芯片检测和TCGA数据显示，肾透明细胞癌组织中Notch表达明显增加［8］，Notch1基因过表达导致肾脏细胞过度增殖，同时Notch1配体Jagged1的高表达降低了肾癌患者总生存期和无病生存期［21］。敲除Notch信号可下调Myc和Cyclin A1的表达阻断ccRCC细胞生长周期，抑制增殖［8］；Notch抑制剂处理后的裸鼠可以有效抑制肾癌细胞移植瘤生长［25］。团队研究发现，软坚散结方促进肾透明细胞癌细胞系7860凋亡，其机制是通过阻断Notch1及凋亡信号通路［22］。为此，本研究在前期基础上，进一步通过体内实验证明软坚散结方通过阻断Notch信号（DAPT组）可抑制7860细胞裸鼠移植瘤生长，并下调Bcl-2，上调Bax等凋亡因子；软坚散结方组与DAPT组比较，具有更明显的抑瘤作用，下调Notch1表达与DAPT作用相当，与DAPT组相比，NICD、Bcl-2显著下降，Bax表达显著上升，说明软坚散结方通过抑制Notch通路调控相关凋亡因子抑制肾透明细胞癌癌组织生长，这与既往在体、离体实验结论一致［8，20］。其中NICD为Notch剪切后的胞内段，并进入细胞核与转录因子CSL结合形成NICD/CSL复合体，激活下游通路，而本研究中软坚散结方对NICD有更强的调控作用，推测软坚散结方可能阻滞了Notch1的切割，或在核内阻断NICD/CSL复合体的形成，或软坚散结方协同阻滞Notch相关交叉通路共同诱导凋亡。

综上所述，软坚散结方可有效抑制移植瘤肿瘤生长，其作用机制可能与靶向阻断Notch信号表达，从而进一步诱导凋亡有关。值得注意的是，软坚散结方相比DAPT阻断剂具有更明显抑瘤效果及促凋亡作用，这可能是中药多组分多通路多靶点协同调控的结果。本研究涉及的蛋白表达较少，且未涉及交叉通路，软坚散结方对裸鼠肾透明细胞癌的作用机制值得进一步研究。