水翁花不同极性提取物体外抗氧化活性实验性研究

罗 清，戴卫波，严梓林

（1.广州中医药大学附属中山医院，广东 中山528400；2.广东药科大学，广东 中山528400）

水翁花，别名水雍花、大蛇药、水翁仔、水榕花等，为桃金娘科植物水翁花Cleistocalyx operculatus（Roxb.）Merr.et Perry的干燥幼嫩花蕾，具有清热解暑、生津止渴、去湿消滞之功效［1］。我院以水翁花为主要药物制成的中药制剂青莲外感袋泡茶（批准文号：粤药制字Z20071002）具有疏风解表、清热解毒之功效，用于外感风热感冒、发热头痛、咽喉肿痛、上呼吸道炎、扁桃体炎见上述证候者，深受广大患者喜爱。近现代药理研究发现水翁花具有抗炎、解热镇痛［2］、抗内毒素［3-4］、降血糖［5］、抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、保护神经细胞氧化损伤和膜脂氧化［7］、逆转肝癌多药耐药［8］、抗炎保肝［9］、诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡［10］、影响过氧化氢诱导神经细胞凋亡作用［11］等多种活性。关于水翁花体外抗氧化性的实验研究未见报道，为了进一步研究水翁花的药效机制，为开发以水翁花为基础的复方中药制剂提供重要依据，本研究对水翁花不同极性提取物的体外抗氧化性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 电子分析天平（型号：BS-224S；厂家：北京SARTORIUS）、超声波清洗器（型号：KQ5200E；厂家：昆山超声仪器有限公司）、分光光度计（型号：UV-2550；厂家：岛津SHIMADZU）、直热式电热恒温干燥箱（型号：东方-A；厂家：广州东方电热干燥设备厂）、高速多功能粉碎机（型号：JP-300A；厂家：永康市久品工贸有限公司）

1.1.2 药材与试剂 水翁花（广州康圣药业有限公司提供，批号：20180808）、95%乙醇（广州化学试剂厂，批号：20190802）、无水乙醇（广东西陇科学股份有限公司，批号：1708011）、DPPH（上海梯希爱化成工业发展有限公司，批号：BFQNI-SL）、维生素C（美国Amresco公司，批号：2626C211）。

1.2 实验方法

1.2.1 水翁花提取物粉末的制备

1.2.1 .1 水翁花乙醇提取液的制备 准确称取水翁花药材200 g，粉碎，于蒸馏烧瓶中，用95%乙醇1000 mL水浴回流提取2次，每次1.5 h。合并滤液，过滤，回收乙醇并浓缩，残渣加水用超声提取法提取5 h，提取液浓缩后得到水翁花总醇提取液共50 mL（1 mL相当于原药材4 g）。

1.2.1 .2 水翁花总醇提液不同极性溶剂的萃取 取水翁花总醇提液50 mL于水浴锅中蒸干，残渣用少量蒸馏水超声溶解，定容至30 mL，平均分成3份，每份10 mL于分液漏斗中，分别用1∶1石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行多次萃取，直至萃取液为无色。分别合并各萃取液保存备用，各溶剂萃取后剩余的水层溶液合并保存备用。

1.2.1 .3 提取物粉末的制备 将上述各萃取液分别减压挥干，残渣用95%乙醇溶解，50 mL试管中离心分离后于水浴锅中挥去乙醇至无醇味，水层液于水浴锅中直接浓缩挥干，各残渣于50℃烘箱中干燥至恒重并称重，得到水翁花石油醚层粉末（A）、乙酸乙酯层粉末（B）、正丁醇层粉末（C）和水层液粉末（D）质量分别为0.472 g、3.414 g、1.074 g、0.112 g。

1.2.1 .4 DPPH乙醇溶液的制备 准确称取DPPH粉末4 mg于烧杯中，加少量无水乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用无水乙醇洗涤烧杯3次，将洗涤液转入容量瓶中，加无水乙醇至刻度线，摇匀，配成浓度为0.04 mg/mL的DPPH乙醇溶液（注：此溶液为现配现用）。

1.2.2 抗氧化活性的测定

1.2.2 .1 石油醚提取物抗氧化活性的测定 （1）石油醚提取物抗氧化活性预测定：准确称取粉末A100 mg于烧杯中，先用少量95%乙醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，烧杯用95%乙醇洗涤3次，将洗涤液一并转入容量瓶中，加95%乙醇至100 mL，摇匀，配成1 mg/mL的母液。再把母液分别稀释成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的子溶液。分别取上述各浓度的子溶液5 mL与0.04 mg/mL的DPPH溶液5 mL混合，37℃避光孵化30 min，观察颜色变化，判断其清除率的范围。通过预测定选取浓度为0.03、0.025、0.02、0.015、0.01 mg/mL的子溶液测定其吸光度。（2）石油醚提取物抗氧化活性的测定：DPPH抗氧化活性测定采用Wang Dacheng等［12-13］方法，并稍作调整。取离心管3支，分别加入0.03 mg/mL子溶液和0.04 mg/mL的DPPH溶液各5 mL，混合摇匀，37℃避光静置孵化30 min。同时用该浓度溶液5 mL与5 mL的无水乙醇混合液进行空白调零，测定波长为517 nm的吸光度，取3支管吸光度的平均值，记为A样品。按此方法，测定其余各浓度子溶液和浓度为0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。另取0.004 mg/mLDPPH溶液与95%乙醇各5 mL混匀，用无水乙醇进行空白调零，测定波长517 nm下的吸光度，重复3次，取平均值，记为ADPPH。清除率（%）=［1-A样品/ADPPH］×100%，以萃取液浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，水翁花石油醚萃取液在浓度0～0.030 mg/mL范围，线性关系为y=26.669x+0.0219，线性关系良好（r2=0.9964），IC50=0.0179 mg/mL。

1.2.2 .2 其余萃取物抗氧化活性测定 取100 mg粉末B、C和D按母液和子液配制方法分别配成相同浓度的母液和子液，并按上述抗氧化活性预测定方法选取浓度，其中乙酸乙酯、正丁醇萃取液选取0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL的子溶液测定其吸光度，水层液选0.035、0.030、0.025、0.020、0.015 mg/mL的溶液测定其吸光度。DPPH抗氧化活性测定具体方法参照“1.2.2.1”测定各子溶液浓度与0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。以浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线。结果水翁花乙酸乙酯萃取液在浓度0～0.05 mg/mL范围，线性关系为y=18.082x+0.0264，线性关系良好（r2=0.9943），IC50=0.0262mg/mL。正丁醇萃取液在浓度0～0.030 mg/mL范围，线性关系为y=26.53x+0.0069，线性关系良好（r2=0.9942），IC50=0.0186 mg/mL。水层液在浓度0～0.035 mg/mL范围，线性关系为y=22.089x+0.0314，线性关系良好，（r2=0.9925），IC50=0.0212 mg/mL。

1.2.2 .3 维生素C抗氧化活性的测定 取10 mg维生素C，按“1.2.2.1”配制方法配成0.1 mg/mL维生素C乙醇溶液母液。再把母液稀释成0.08、0.06、0.04、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002 mg/mL的维生素C乙醇子溶液。并按“1.2.2.1”预测定，选取0.007、0.006、0.005、0.004、0.003 mg/mL的溶液测定其吸光度。参照“1.2.2.1”项，石油醚抗氧化性测定各浓度与0.004 mg/mL的DPPH溶液混合后的吸光度。结果维生素C乙醇溶液在浓度0～0.007 mg/mL范围，线性关系为y=108.14x+0.0185，线性关系良好（r2=0.9948），IC50=0.004453 mg/mL。

2 结果

2.1 水翁花不同极性提取物的DPPH自由基清除率

水翁花不同极性提取物都具有一定的自由基清除率，且随浓度升高，自由基清除率越强。在浓度相同时（以0.03 mg/mL为例），石油醚提取物的自由基清除率最强，为79.6853%，其次为正丁醇提取物（77.4854%），水层次之（70.5046%），乙酸乙酯提取物最弱（58.3502%），这与各提取物的IC50（图1）结果相一致，表明水翁花不同极性提取物的自由基清除率在浓度相同时以石油醚提取物最高，其次为正丁醇提取物，水层再次之，乙酸乙酯提取物最弱。结果见表1。

表1 水翁花不同极性萃取物的DPPH自由基清除率

2.2 不同极性溶液DPPH自由基清除率比较

水翁花石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、水层液自由基清除率的IC50分别为0.0179 mg/mL，0.0262 mg/mL，0.0186 mg/mL，0.0212 mg/mL，表明水翁花不同极性提取物都具有不同程度的抗氧化活性，其中石油醚萃取物的IC50最小，抗氧化性最强，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于维生素C（IC50为0.004 453 mg/mL）。结果见图1。

图1 不同极性提取溶液DPPH自由基清除率对比图

3 讨论

自由基是人体内各种生化反应的中间代谢产物，其异常累积使得机体发生氧化损伤，进而引发疾病，如肝癌、肝纤维化、阿尔茨海默病、糖尿病及心血管等疾病［14］。现代药理研究发现，很多含黄酮类、多糖、维生素族、皂苷、生物碱等成分的清热解毒类的中药如黄芪［15］、柴胡［16］、丹参［17］等中药及其提取物均可通过清除自由基发挥抗氧化作用，是天然抗氧化剂的主要来源。天然抗氧化剂能有效延缓衰老和治疗衰老所引起的疾病，在我国逐步迈入老龄化社会的今天，寻找天然抗氧化剂来源也将成为今后的重点研究方向。

水翁花作为广东地产药材，具有清热解暑、生津止渴、去湿消滞之功效，夏天常作为凉茶饮用。关于水翁花的研究近年来比较多，且逐渐深入，特别是水翁花中一种活性成分2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）已被证实具有抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶活性［6］、降血糖［5］、抗炎保肝［10］、保护神经细胞活性等多种作用［7］。本课题前期研究也表明，水翁花具有抗内毒素作用［3］，可通过降低小鼠血清中一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量，减少细菌内毒素所致动物死亡率，因NO是引发氧化应激损伤的关键因子之一，TNF-α是引发炎症级联反应的重要因子之一，表明水翁花抗内毒素作用与抑制机体氧化应激和炎症水平有密切关系［4］，说明其可能与抗氧化活性有关。

本研究采用DPPH自由基清除法对水翁花不同极性提取物的体外抗氧化活性进行研究，并与维生素C作阳性对照。结果表明水翁花不同极性提取物都具有一定程度的自由基清除率，且随浓度升高，自由基清除率越强，在同一浓度下石油醚提取物的自由基清除率最高，其次为正丁醇提取物，水层次之，乙酸乙酯提取物最弱，其自由基清除率的IC50值由低到高分别是石油醚提取物、正丁醇提取物、水层液、乙酸乙酯提取物，与自由基清除率的强弱结果相一致，表明石油醚萃取物的抗氧化性最强，正丁醇次之，乙酸乙酯萃取液最弱，但均稍弱于维生素C。这一结果从侧面证明水翁花具有的多种活性都可能与其具有的抗氧化活性有关，但体内抗氧化及具体哪种成分对抗氧化起到主要作用还有待进一步研究。