知母皂苷对记忆障碍模型大鼠学习记忆的影响

张文新，任沁沁

（1.山西卫生健康职业学院，山西 晋中030619；2.南方医科大学，广东 广州510515）

知母为百合科植物知母的干燥根茎，是常用清热滋阴药物，味苦，性寒无毒，归肾经，具有清热泻火、生律润燥、止咳除烦的功效［1］，主要含有甾体皂苷、双苯吡酮类、木脂素类、多糖类、氨基酸类、生物碱类等多种成分。现代研究表明，知母根茎中所含的甾体皂苷知母皂苷（Saponins from anemarrhena asphodeloides Bge，SAaB）（约含6%）是知母的主要活性成分［2］，其可分为知母皂苷A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、B-Ⅰ和B-Ⅱ6种，其皂苷的皂苷元主要是菝葜皂苷元［3］。药理研究表明，知母具有抗血小板血栓［4］、改善阿尔茨海默病、抗肿瘤、抗炎、解热等作用［5］。知母皂苷具有明显抗抑郁和抗脑缺血作用，能通过促进脑M受体生成，对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的影响，对脑内自由基代谢的影响，对学习记忆的影响等发挥抗衰老作用［6］，对于阿尔茨海默病（老年性痴呆，Alzheimer′s disease，AD），改善学习记忆能力具有明显的效果［7］。

记忆是大脑的最高功能之一，是智力的重要构成因素。国内外对记忆力减退从多方面进行了广泛地深入的研究，合成药物方面也取得了一定的进展，但大多有疗效不高、药价昂贵、长期服用不良反应明显等种种不足。如利他灵，被称为“聪明药”，能增强记忆力，但长期服用会导致厌食、成瘾等［8］。因此，开发低毒、价廉的提高学习记忆力的药物已成为当前医药界面临的一个重大课题。本研究采用东莨菪碱腹腔注射大鼠的方法制造记忆障碍模型，研究知母皂苷对其学习记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雌性2月龄SD大鼠32只，SPF级，体质量（200±20）g，实验动物合格证号：2006B023，由南方医科大学实验动物中心提供，在温度（22±2）℃，湿度（50±10）%环境下饲养3 d后实验，本研究获得伦理委员会批准。

1.1.2 实验仪器Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所仪器厂，型号：SMG-2）；紫外可见分光光度计（美国惠普公司，型号：HP845）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司产品，型号：DZF-8050）；万分之一天平（德国sartorius，型号：CP324S）；十万分之一天平（德国sartorius，型号：CP225D）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-2000）；医用超声仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：Q-500DE）；真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DZF-8050）。

1.1.3 药物与试剂 知母饮片（购于北京同仁堂药店）；LSA-10型大孔吸附树脂（西安蓝深公司）；菝契皂苷元对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110744-200306）；氢溴酸东莨菪碱（广州环叶制药有限公司，批号：010402）；生理盐水；蒸馏水；乙醇、丙酮、甲醇、硫酸为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 知母皂苷的制备

1.2.1 .1 提取浓缩 取适量的知母饮片，加1倍量70%乙醇浸润24 h后，再加8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2 h，纱布滤过。合并滤液，减压回收乙醇，浓缩成流浸膏（药材质量∶溶液体积=2∶1），浓缩液通过陶瓷膜过滤器过滤，滤液加蒸馏水稀释至1∶1（药材质量∶溶液体积），备用。

1.2.1 .2 大孔吸附树脂洗脱 取适量LSA-10型大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，搅拌使气泡逸出，装柱，用蒸馏水洗至无醇味，取浓缩液上样，吸附1 h，然后依次用10 BV的20%乙醇、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，洗脱流速1 mL/min，收集50%乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏状。

1.2.1 .3 丙酮萃取 将浸膏用1/2倍量的无水乙醇溶解，然后缓缓加入2倍量丙酮，混合均匀，静置12 h，有白色沉淀析出，过滤，滤液弃，沉淀干燥，即为知母皂苷。

1.2.2 知母皂苷含量的测定

1.2.2 .1 对照品母液的制备 精密称取菝葜皂苷元对照品2.512 mg，置10 mL容量瓶中，加适量甲醇，超声溶解，放冷，继续用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 .2 供试品溶液的制备 取知母皂苷样品约0.18 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加适量甲醇溶解后，加浓硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中显色30 min，取出，冰浴至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

1.2.2 .3 测定波长的确定 取菝葜皂苷元对照品溶液适量，照标准曲线项下的方法制备标准品溶液，采用紫外分光光度法，在波长范围200~700 nm进行扫描，菝葜皂苷元对照品溶液的最大吸收波长为284 nm，且样品在该波长处有较大吸收峰且峰形良好，故以284 nm作为最大吸收波长。

1.2.2 .4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分别置10 mL容量瓶中，分别加入5.0 mL浓硫酸摇匀，密塞。在60℃的水浴中显色30 min，取出，冰浴至室温，继续加甲醇至刻度，摇匀。以第一个容量瓶中的试剂为空白对照，在284 nm处测定对应的吸光度。以浓度X（μg/mL）为横坐标，吸光度Y为纵坐标，运用Excel数据进行线性回归，得回归曲线方程：Y=21.514X+0.032，r=0.9976，线性范围：5.02~25.10 μg/mL。

1.2.2 .5 精密度试验 取对照品溶液一份，照标准曲线的制备项下的方法，连续测定其吸光度5次，计算出RSD为1.42%，表明精密度良好。

1.2.2.6重复性试验 取知母皂苷样品粉末5份，每份约0.18 mg，精密称定，置10 mL的容量瓶中，加适量甲醇溶解后，加浓硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中显色30 min，取出，冰浴至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，284 nm处测定吸光度，计算样品中知母皂苷的含量，计算出RSD为2.65%，重复性良好。

1.2.2 .7 稳定性试验 精密称取知母皂苷样品粉末约0.18 mg，加适量甲醇溶解后，加浓硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中显色30 min，取出，冰浴至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别于0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h在284 nm处测定供试品溶液的吸光度，计算RSD为1.34%，表明样品在2.5 h内的稳定性良好。

1.2.2 .8 加样回收率试验 取已知含量的知母皂苷样品粉末5份，每份约2.00 mg，精密称定，分别置25 mL容量瓶中，再分别精密加入约1.70 mg的菝葜皂苷元对照品，加甲醇，超声溶解，定容，再精密量取各样品溶液1 mL至10 mL量瓶中，加浓硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中显色30 min，取出，冰浴至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，照标准曲线项下方法操作测定吸光度，计算样品中知母皂苷的含量和回收率。计算得平均回收率为98.43%，RSD=3.25%。

1.2.2 .9 样品的含量测定 取供试品溶液，在空白试剂为对照，在284 nm处测定吸光度，根据标准曲线的回归方程，计算样品中知母皂苷的含量，平行测定3次，取平均值。

1.2.3 分组与给药 取32只SD雌性大鼠，随机分为空白对照组、记忆障碍模型组、知母皂苷低剂量组（50 mg/kg）、知母皂苷高剂量组（100 mg/kg）4组，每组8只。从实验第1天起，空白对照组、记忆障碍模型组大鼠灌胃给予相应体积的生理盐水（1 mL/100 g），知母皂苷高（100 mg/kg）、低剂量组（50 mg/kg）灌胃给予相应剂量的知母皂苷，每天1次，连续8 d。

1.2.4 行为学训练Morris水迷宫实验：水温控制在22℃左右，室温控制在25℃左右，实验前1天，让所有大鼠在水迷宫中自由游泳2 min，以熟悉周围环境；实验1～7 d，各组大鼠逐个称重，灌胃给予相应的药物，给药1 h后开始游泳训练，每天每只大鼠训练4次，训练时，将大鼠面向池壁依次从4个入水点分别放入水池，记录大鼠从入水到找到水下隐蔽平台并站立于其上的路线及所用的时间（潜伏期），用秒（s）表示，大鼠找到平台后，让其在平台上站立10 s。若入水后120 s大鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中引导至平台，并停留10 s，然后进行下一次训练，这时潜伏期记为120 s。每只大鼠从4个入水点分别放入水池为1次训练，2次训练之间间隔60 s。

1.2.5 造模 实验第8天，模型组、高剂量组、低剂量组腹腔注射东莨宕碱（0.3 mg/mL）1 mL/100 g造成记忆障碍模型，空白对照组则给予相应剂量的生理盐水。

1.2.6 观察指标 每只大鼠造模30 min后游泳，这次游泳随机指定一个入水点，观察和记录大鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间，记录其潜伏期。在120 s内未找到平台者，潜伏期记为120 s。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0软件对潜伏期进行统计学分析。各组数据以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样品中知母皂苷的含量

知母饮片经70%乙醇提取，大孔吸附树脂洗脱，丙酮沉淀的工艺提取纯化后，以菝葜皂苷元为对照，采用紫外可见分光光度法检测样品中的知母总皂苷的含量，经检测样品中知母皂苷的含量达85%以上。

2.2 不同时期大鼠的游泳轨迹

大鼠在游泳训练中，从刚开始的边缘式、随机式路线寻找平台变成了以直线式、趋向式路线搜索平台，表明随着训练次数和时间的增加，大鼠找到平台的时间逐渐减少，路线也逐渐缩短，说明游泳训练方法有效果，大鼠能快速精准地找到平台。结果见图1。

图1 Morris水迷宫中不同时期大鼠的游泳轨迹图

2.3 大鼠游泳的潜伏期

与空白对照组比较，记忆障碍模型组大鼠的潜伏期时间显著升高（P＜0.01）。与记忆障碍模型组比较，知母皂苷低、高剂量组大鼠的游泳潜伏期时间显著缩短（P＜0.05）。结果见表1。

表1 知母皂苷对东莨宕碱诱导的学习记忆损伤的影响 （±s）

表1 知母皂苷对东莨宕碱诱导的学习记忆损伤的影响 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P<0.01；与记忆障碍模型组比较，2）P<0.05，3）P<0.01

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3 讨论

阿尔茨海默病发病机制不明，是一种伴有认知障碍和记忆丧失的神经退行性疾病［9］。胆碱功能障碍是AD患者记忆功能损伤的原因之一，乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）为脑内与认知功能最直接相关的神经递质［10］，东莨菪碱是一种经典的抗胆碱能剂，可竞争性地与ACh受体结合，从而阻断拟胆碱药物对胆碱受体的激动作用，使得体内的ACh含量降低［11］，因此，东莨菪碱常常用于诱导动物AD记忆障碍模型。

知母总皂苷是知母防治老年痴呆症的有效部位，本研究采用大孔吸附树脂洗脱—丙酮萃取工艺制备知母皂苷，经紫外分光光度法检测知母皂苷的含量达85%以上，进而研究知母总皂苷对东莨菪碱致记忆障碍模型大鼠学习记忆能力的影响。Morris水迷宫广泛用于啮齿类动物的空间记忆学习能力的测量中，在最初的游泳训练中，大鼠主要以边缘式和随机式寻找平台，潜伏时间较长，随着训练时间的增加，大鼠主要以直线式和趋向式搜索平台，游泳的时间明显缩小，路线缩短，说明游泳训练方法有效，大鼠学会了寻找平台的方法和路径。腹腔注射东莨菪碱后，模型组大鼠与空白对照组比较，游泳潜伏期时间明显延长，说明造模成功。造模后高剂量组大鼠寻找到平台所需的潜伏期与模型组相比明显缩短（P<0.01），低剂量组大鼠寻找到平台所需的潜伏期与模型组相比有所降低（P<0.05）。说明知母皂苷可以改善大鼠的学习记忆能力。综上所述，知母皂苷对东莨菪碱所致记忆障碍的大鼠模型有明显提高记忆力的作用，其机制可能与影响胆碱能神经的活性有关。