补肾消渴方对糖尿病肾病模型大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

孙亚林，傅 强，夏建华，金周慧

（上海市浦东新区人民医院中医科，上海201299）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者最严重的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要病因之一。糖尿病肾病确切发病机制十分复杂，包括了诸多因素共同参与，如遗传、肾脏血流动力学异常、血糖过高引起的代谢改变、高血压、血管活性物质代谢异常等因素［1］。糖尿病肾病的结节性和弥漫性肾纤维化是其特征性改变。寻找更加安全有效的治疗措施和药物延缓糖尿病肾病肾纤维化一直是肾脏病领域的研究热点［2］。本研究采用高脂高糖饮食联合小剂量链脲菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射法建造DN大鼠模型，探讨补肾消渴方对糖尿病肾病治疗作用的机制，以便为中医药防治糖尿病肾病提供更好的方法和实验研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物28只SP F级SD雄性大鼠，体质量160～180 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证编号SCXK（沪）2013-0016。饲养于复旦大学药学院动物房，动物实验室许可证号：SYXK（沪）2010-0099。

1.1.2 实验试剂STZ链脲菌素，批号：S0130，美国Sigma公司产品；大鼠尿微量白蛋白ELISA试剂盒，批号：YS03669B，南京建成生物科技有限公司产品；兔抗大鼠转化生长因子β（1transforming growth factor β1，TGF-β1）单克隆抗体，AB215715，美国Abcam公司产品；兔抗大鼠Smad2、Smad3、PSmad2、平滑肌肌动蛋白α（smooth muscle aorta α，α-SMA）单克隆抗体，批号：8685S、8685T、52631S、19245S，美国CST公司生产；HRP标记山羊抗兔IgG（H+L），批号：bs-0791R；PBS磷酸盐缓冲液，批号：AR0030，武汉博士德公司产品；ECL发光显色液，批号：1705060，美国Bio-Rad公司产品；BCA蛋白定量试剂盒，批号：P0009，上海碧云天生物科技有限公司产品。

1.1.3 实验药物 高脂饲料：由66.5%常规饲料，20.0%蔗糖，10.0%猪油，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐［11］组成，该饲料由苏州双狮实验饲料科技有限公司提供；补肾消渴方药物组成：黄芪30 g，金蝉花10 g，红豆杉9 g，西红花1 g，枸杞12 g，绞股蓝12 g，灵芝15 g，葛根15 g。由上海中医药大学附属普陀医院中药房制备成浓缩原液，含生药104 g；肾炎康复片，批号：AP15425，天津同仁堂制药有限公司产品，研磨后溶解于生理盐水中。4℃下冰箱保存备用。

1.1.4 实验仪器 罗康全活力型血糖仪及其配套试纸，德国Roche公司；低温离心机（Micro21R），美国Thermo公司；透射电镜电子显微镜（JEM1230），日本电子株式会；石蜡切片机（Finesse 325），美国Thermo公司；酶标仪（SpectraMax M5），美国Bio-Rad公司；全自动生化检测仪（INTEGRA 400），瑞士Cobas公司；石蜡组织块包埋机（Scientific），美国Thermo公司；显微镜（CH2），日本Olympus公司；微量移液器（F1-ClipTip），美国Thermo公司；低温冰箱（Forma 700），美国Thermo公司；Image Lab图像采集和分析软件，美国Bio-Rad公司；电泳槽（1640302），美国Bio-Rad公司；转膜槽（1703940），美国Bio-Rad公司；摇床（SI-50），英国Stuart公司；旋转振荡器（XW-80A），上海青浦沪西仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模28只SPF级SD雄性大鼠，适应性饲养后，随机分为正常对照组（6只）、模型对照组（6只）、补肾消渴方组（7只）、肾炎康复片组（7只）。除正常对照组外，其余各组均采用高脂高糖饮食4周后加大鼠腹腔注射低剂量STZ（30 mg/kg）的造模方法制作动物模型［3］。

1.2.2 动物给药 造模成功后，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水灌胃；补肾消渴方组给予补肾消渴方，制成浓缩原液，按每日4.2 g/kg灌胃。肾炎康复片组将肾炎康复片研磨后溶解于生理盐水中，按每日2.4 g/kg灌胃给药。第8周时尾静脉采血，测定大鼠血糖；第8周末测定大鼠血肌肝（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。第8周末处死大鼠前，用代谢笼收集大鼠尿液，在代谢笼收集大鼠尿液期间禁食不禁水，收集到大鼠尿液之后，记录各组大鼠尿量，将收集到的尿液测定大鼠24 h尿微量白蛋白排泄率（UAER）；测定肾脏指数（kidney index，KI），KI=肾质量/体质量×1000。

1.3 肾组织病理学检测

大鼠肾脏石蜡切片制备：大鼠肾脏在4%多聚甲醛中固定；乙醇梯度脱水；二甲苯透明；浸蜡；包埋；切片，每张切片厚3 μm，用经0.1%多聚赖氨酸处理，56℃保温箱内烘干，存于4℃冰箱待用。

HE染色：石蜡切片，脱蜡，乙醇洗涤，苏木精染色，1%盐酸乙醇分化，伊红染色，脱水，透明，中性树胶封片。

免疫组化染色（SABC法）：常规切片、脱蜡、水化；PBS水洗，3% H2O2室温封闭，抗原修复；滴加正常山羊血清封闭液；兔抗大鼠一抗；滴加山羊抗兔二抗；滴加试剂SABC；DAB显色；苏木素复染，脱水，透明，封片，镜检。

Western blot检测方法：组织经粉碎、缓冲、裂解、离心后；电泳ECL化学发光法显影。采用Image LabTM图像采集和分析软件成像，对各组肾组织HE染色，免疫组化染色和条带进行分析。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组之间采用单因素方差分析（ANOVA），方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者采用Games-Howell检验，当P<0.05时，表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般性状

实验开始，从腹腔注射STZ 1周之后，各造模组大鼠逐渐开始出现多饮多食，而形体相对正常对照组消瘦的症状，部分大鼠逐渐出现毛色枯黄，没有色泽等现象，在实验过程中，模型对照组大鼠部分出现白内障等眼部疾病，补肾消渴方和肾炎康复片组大鼠白内障症状很少。

2.2 各组大鼠治疗前后体质量和肾指数变化

与正常对照组比较，模型对照组、补肾消渴方组和肾炎康复片组体质量降低，肾指数升高（P<0.01），差异有统计学意义。与模型对照组比较，补肾消渴方组和肾炎康复片组体质量升高，肾指数降低（P<0.01）。与肾炎康复片组比较，补肾消渴方组体质量升高，肾指数降低（P<0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠8周末体质量、肾指数（KI）、24 h-UAER的比较 （±s）

表1 各组大鼠8周末体质量、肾指数（KI）、24 h-UAER的比较 （±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01；与模型对照组比较，2）P<0.01；与肾炎康复片组比较，3）P<0.01

组别 例数 体质量（g） KI（mg/g）UAER（μg/24 h）正常对照组 6 584.40±5.59 2.28±5.75 71.50±10.17模型对照组 6 437.92±8.21） 4.99±0.061）1473.75±111.471）补肾消渴方组 7 509.46±9.721）2）3）3.36±0.061）2）3）583.59±59.111）2）3）肾炎康复片组 7 475.20±8.791）2）3.78±0.041）2）802.37±79.211）2）

2.3 各组大鼠第8周末24 h UAER比较

实验8周末时，模型对照组24 h UAER与正常对照组比较明显升高（P<0.01）；补肾消渴方组24 h UAER与模型对照组和肾炎康复片组比较明显降低（P<0.01）。结果见表1。

2.4 各组大鼠0周、4周、8周血糖变化

给药第0、4、8周，模型对照组、补肾消渴方组和肾炎康复片组大鼠血糖与正常对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；给药第4、8周，补肾消渴方组大鼠血糖与模型对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；给药第8周，补肾消渴方组大鼠血糖和肾炎康复片组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。

“订单式”人才培养是校企合作、校园合作的另一种方法。在云南经济管理学院陈香艳的《高职院校学前教育专业实施“订单班”的几点思考》中提出：“订单式”人才培养是当下我国职业教育体系中校企合作的重要方式，按照企业的要求去培养人才能节约很多成本，对应用型人才培养具有积极作用。在“订单式”人才培养的过程中，第一，了解市场人才的需求情况。第二，确定订单培养账目。第三，组建账目工作组。第四，建全组织保障制度。第五，进行校园之间的深度融合。订单式人才培养已是高职教育实践中一种有效的人才培养模式，值得地方本科院校学习、借鉴、推广。

表2 各组大鼠第0周、4周、8周血糖变化情况（mmol/L，±s）

表2 各组大鼠第0周、4周、8周血糖变化情况（mmol/L，±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01；与模型对照组比较，2）P<0.01；与肾炎康复片组比较，3）P<0.01

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2.5 各组大鼠第8周末BUN、Scr比较

给药第8周末时，模型对照组、补肾消渴方组和肾炎康复片组BUN、Scr水平与正常对照组大鼠比较差异具有统计学意义（P<0.01）；补肾消渴方组BUN、Scr水平与模型对照组及肾炎康复片组比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠8周末BUN、Scr水平比较 （±s）

表3 各组大鼠8周末BUN、Scr水平比较 （±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01；与模型对照组比较，2）P<0.01；与肾炎康复片组比较，3）P<0.01

组别 例数 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）正常对照组 6 5.75±0.52 54.56±2.29模型对照组 6 18.3±1.951） 96.76±5.331）补肾消渴方组 7 13.26±0.941）2）3） 64.21±2.691）2）3）肾炎康复片组 7 15.26±0.581）2） 69.42±4.51）2）

2.6 病理结果

2.6.1 肾组织HE染色观察HE染色结果可见：正常对照组大鼠，肾脏组织无明显的病理改变。模型对照组与正常对照组相比，出现肾小球系膜细胞增生，基底膜增厚，部分肾小球硬化，部分肾小管上皮细胞显示空泡样变性，有不同程度的炎性细胞浸润；补肾消渴方组肾小球、肾小管损伤程度与模型对照组及肾炎康复片组比较差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结果见图1，2。

图1 各组大鼠肾组织HE染色病理图像分析结果

图2 各组大鼠肾组织HE染色（×400)

2.6.2 TGF-β1、α-SMA免疫组化表达 模型对照组中TGF-β1、α-SMA明显高于正常对照组（P<0.01）；补肾消渴方组肾脏中TGF-β1、α-SMA表达与模型对照组及肾炎康复片组比较差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结果见图3，4；表4。

图3 各组大鼠TGF-β1免疫组化（×400）

图4 各组大鼠α-SMA免疫组化（×400）

表4 各组大鼠TGF-β1、α-SMA肾组织平均灰度值比较 （±s）

表4 各组大鼠TGF-β1、α-SMA肾组织平均灰度值比较 （±s）

注：与正常对照组比较，1）P<0.01；与模型对照组比较，2）P<0.01；与肾炎康复片组比较，3）P<0.01，4）P<0.05

组别 例数 TGF-β1 α-SMA皮质 髓质 皮质 髓质正常对照组 6 79.5±4.0 88.0±6.9 56.1±3.3 55.6±3.9模型对照组 6 115.0±5.81）119.6±6.81）57.8±2.71）59.7±4.21）补肾消渴方组 7 101.6±6.91）2）4）107.1±6.61）2）4）59.9±3.52）3）61.4±2.82）3）肾炎康复片组 7 109.3±8.11）2）114.8±6.31）2）61.5±1.61）2）64.1±3.91）2）

2.6.3 TGF-β1、α-SMA蛋白Western blot表达 与正常对照组比较，模型对照组的TGF-β1、α-SMA蛋白表达明显增高（P<0.01）；补肾消渴方组肾脏中TGF-β1、α-SMA蛋白表达与模型对照组及肾炎康复片组比较差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。结果见图5~8。

图5 各组大鼠肾脏中TGF-β1蛋白表达

图6 各组大鼠肾脏中TGF-β1蛋白表达比较

图7 各组大鼠肾脏中α-SMA蛋白表达

图8 各组大鼠肾脏中α-SMA蛋白表达比较

2.6.4 Smad2/Smad3蛋白表达情况 模型对照组与正常对照组比较，Smad2、Smad3蛋白表达无明显变化（P>0.05）；补肾消渴方组与模型对照组和肾炎康复片组比较，Smad2、Smad3蛋白表达差异也无统计学意义（P>0.05）。结果见图9，10。

图9 各组大鼠肾脏中Smad2蛋白表达比较

图10 各组大鼠肾脏中Smad3蛋白表达比较

2.6.5 P-Smad2/P-Smad3蛋白的表达 模型对照组P-Smad2、P-Smad3蛋白表达明显高于正常对照组（P<0.01）；补肾消渴方组P-Smad2、P-Smad3蛋白表达明显低于模型对照组及肾炎康复片组（P<0.01，P<0.05）。结果见图11，12。

图11 各组大鼠肾脏中P-Smad2/P-Smad3蛋白表达

图12 各组大鼠肾脏中P-Smad2/P-Smad3蛋白表达比较

3 讨论

补肾消渴方主要由黄芪、金蝉花、红豆杉、枸杞、灵芝、葛根、绞股蓝和西红花组成。方中黄芪味甘、性温，具有补气生血，使气旺血生；金蝉花性寒、味甘，具有益肾补肺、调和营卫的功效，两药一温一凉，黄芪大补脾肺之气，以资化源，使气旺血生，金蝉花益肾精、敛肺气、和营卫，则浮阳秘敛，阳生阴长，气旺血生，虚热自退，二者共为君药；红豆杉味甘、平，归肾、心经，有小毒，消肿散结、通经利尿；西红花味甘，性平，归心、肝经，活血化瘀、凉血解毒、解郁安神，两药共为臣药，具有消肿散结、活血化瘀、利尿安神之功。以上诸药共用起到滋补肝肾、益气安神、活血通络的作用。枸杞味甘、性平，归肝、肾经，枸杞子甘平质润，药性平和，是平补肝肾最常使用的中药，可以减红豆杉之小毒；灵芝性平、味甘，归心、肺、肝、肾，补气安神、养肝益精，可以助西红花安神之效；葛根性凉、味甘辛，归脾、胃，具有解肌退热、生津、升举阳气，可助黄芪升阳，解除肌热面赤，口渴引饮；助西红花活血祛瘀。绞股蓝，甘、苦，寒，归脾、肺经，具有益气健脾、清热解毒。以上诸药共为佐药，辅佐主药共奏补肾益气、化瘀通络之功效。

临床研究证实补肾消渴方治疗DN的确切疗效［6］，为了进一步明确其作用机制开展了实验研究。本研究中我们采用补肾消渴方成人60 kg体质量常用剂量，根据《实验动物学》SD大鼠与人体体重6倍换算，确定补肾消渴方治疗量为4.2 g/kg。本研究雄性SD大鼠采用高脂高糖饮食联合小剂量STZ（30 mg/kg）的方法成功建立了糖尿病肾病大鼠模型。

研究发现给予补肾消渴方灌胃治疗8周的大鼠肾指数明显好于模型对照组，血糖、BUN、Scr、UAER等生化指标明显低于模型对照组（P<0.01）。HE染色的结果也显示，补肾消渴方治疗组能够明显降低糖尿病肾病大鼠肾小管空泡样变性，炎症细胞浸润，系膜细胞增生，减轻细胞外基质的堆积，提示补肾消渴方能够改善糖尿病肾病大鼠的肾功能和肾脏病理改变，延缓了糖尿病肾病的进展。

大鼠肾脏免疫组化染色结果显示补肾消渴方组肾组织TGF-β1和α-SMA蛋白的表达低于模型对照组；通过对大鼠肾组织进行Western blot检测结果显示补肾消渴方组大鼠肾脏组织中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表达明显降低，与模型对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）；正常对照组、模型对照组、补肾消渴方组中Smad2/3蛋白表达没有明显变化，提示补肾消渴方可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路，下调TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表达，保护了肾小球和肾小管间质的损伤，改善肾功能。

综上所述，补肾消渴方能降低实验大鼠血糖，降低BUN和Scr，减轻蛋白尿，改善肾功能，能够延缓DN大鼠的病情进展，改善肾组织形态学损害。其作用机制可能通过抑制TGF-β1/Smad通路、下调TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表达有关，这为临床补肾消渴方治疗DN提供了实验依据。