钴纳米颗粒诱导PC12细胞凋亡及氧化应激

李 劲，王俊翔，罗周嵩，郑馥荔，吴思英，李煌元

环境因素如重金属等的暴露能够引起氧化应激，导致神经系统损害，加剧神经退行性疾病的发生发展[1-2]。研究发现，钴纳米颗粒(cobalt nanoparticles, Co-NPs)可能通过多种途径暴露，诱导细胞发生氧化应激，促进细胞凋亡，对人体产生神经损害[3-8]。本研究拟采用大鼠嗜铬细胞瘤细胞PC12作为体外模型，通过检测Co-NPs染毒后的神经损害作用、氧化应激指标变化、核因子类红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2, NRF2)/血红素加氧酶(heme oxygenase-1, HO-1)抗氧化信号通路的激活及NRF2特异性激活剂(tert-butylhydroquinone,tBHQ)预处理，探讨Co-NPs对神经细胞的毒效应及氧化应激作用，为评估Co-NPs的神经毒性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 Co-NPs(中国阿拉丁生化科技股份有限公司)，处理与表征方法及结果见文献[9]。Co-NPs平均粒径为96 nm。zeta电位14.9 mV，多分散指数为0.471。Co-NPs在水溶液中钴离子12 h 的释放率为1.52‰，24 h为1.75‰。DMEM高糖细胞培养基、胎牛血清及抗生素(美国Gibco公司)；Hoechst33258染料(中国碧云天生物技术有限公司)；CCK8试剂盒(中国白鲨生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)试剂盒(中国南京建成生物工程研究所)；Annexin V/7-AAD(美国BD公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、NRF2、HO-1抗体(美国Abcam公司)；tBHQ(美国MCE公司)。

1.1.2 仪器 倒置显微镜(CK40-F200 BH-2型，日本OLYMPUS公司)；生物成像系统(Tanon 4100型，上海天能公司)；垂直电泳槽、电泳仪、转印槽(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(Spectra Max 190型，美国Molecular Devices公司)；流式细胞仪[FACSCanto(TM)Ⅱ型，美国BD公司]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 PC12细胞来自大鼠的嗜铬细胞瘤(中国科学院上海细胞库)，置于含10%胎牛血清、双抗(青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/L)的DMEM高糖细胞培养基中培养(37 ℃，体积分数为0.05的 CO2培养箱)，生长至对数生长期时种板。

1.2.2 Hoechst 33258染色 细胞铺于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs处理24 h后，加入Hoechst3325染色液染色，使用荧光倒置显微镜观察细胞凋亡。每孔选择5个视野统计凋亡数目。

1.2.3 Annexin V/7-AAD染色 细胞铺于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs处理 24 h 后，加入Annexin V/7-AAD染色液染色，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.4 MDA、GSH及GSH-Px含量检测 细胞铺于60 mm培养皿。100、200 μmol/L Co-NPs处理24 h后收集细胞，按照操作说明检测MDA、GSH及GSH-Px含量。

1.2.5 蛋白印迹法(Western-blot) 细胞接种于6孔板中。100、200 μmol/L Co-NPs 处理24 h后，将细胞刮下并移至1.5 mL离心管中，12 000×g离心10 min，收集上清液。取一部分蛋白进行BCA蛋白定量，其余加入蛋白上样缓冲液，100 ℃加热10 min 后置于-20 ℃备用。取20～30 μg蛋白，100 V 电压下10%聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白分离。将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，以奶粉稀释后的GAPDH、NRF2、HO-1(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜。使用1×TBST清洗孵育过的条带后，二抗孵育1.5 h，使用1×TBST清洗，并用ECL显影液显影并曝光。曝光后的条带采用Image J软件进行分析。

1.2.6 CCK8实验 细胞铺于96孔板中。40 μmol/LtBHQ不处理或预处理24 h后加入100、200和400 μmol/L Co-NPs处理24、48 h。将培养基换成含10%CCK8反应液的DMEM培养基，37 ℃反应30 min，置于酶标仪上检测。

1.3 统计学处理 数据采用 SPSS 19.0软件进行分析。多组间比较采用one-way ANOVA进行显著性检验，多组间两两比较采用LSD法进行显著性检验。P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Co-NPs诱导PC12细胞凋亡 Co-NPs处理PC12细胞24 h后，Hoechst33258染色显示，100、200 μmol/L 剂量组细胞凋亡水平分别升高14和24倍(P<0.05，图1A)。Annexin V/7-AAD染色显示，100、200 μmol/L剂量组细胞凋亡水平分别升高15和19倍(P<0.05，图1B)。

n=3。Co-NPs：钴纳米颗粒。A：使用Hoechst33258染料进行染色观察细胞凋亡水平(×100)；B：使用Annexin V/7-AAD染料进行染色观察细胞凋亡水平。与对照组比较，#：P<0.05。

2.2 Co-NPs诱导PC12细胞发生氧化应激 Co-NPs 处理PC12细胞24 h后，200 μmol/L剂量组的细胞内MDA水平升高4倍(P<0.05)。100、200 μmol/L剂量组GSH蛋白含量分别降低14和9 μmol/g(P<0.05)。100、200 μmol/L剂量组GSH-Px分别升高1.5和2.5倍(P<0.05，图2)。

n=3。Co-NPs：钴纳米颗粒；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶。A：Co-NPs处理后MDA含量变化；B：Co-NPs处理后GSH含量变化；C：Co-NPs处理后GSH-Px含量变化。与对照组比较，#：P<0.05。

2.3 PC12细胞NRF2和HO-1蛋白表达水平升高 Co-NPs处理PC12细胞24 h后，100、200 μmol/L剂量组NRF2蛋白表达水平分别升高2.7和2.9倍(P<0.05)；200 μmol/L剂量组的HO-1蛋白表达水平升高1倍(P<0.05，图3)。

n=3。Co-NPs：钴纳米颗粒。NRF2：核因子类红细胞2相关因子2；HO-1：血红素加氧酶。A：NRF2蛋白表达水平；B：HO-1蛋白表达水平。与对照组比较，#：P<0.05。

2.4tBHQ恢复Co-NPs引起的PC12细胞活力下降 100、200和400 μmol/L Co-NPs处理PC12细胞24 h后，细胞活力分别下降了18%、37%和64%(P<0.05)；100、200和400 μmol/L Co-NPs处理PC12细胞48 h后，细胞活力下降了66%、75%和85%(P<0.05)。预处理tBHQ后，细胞活力得到恢复(P<0.05)(图4)。

Co-NPs：钴纳米颗粒；tBHQ：特丁基对苯二酚。与对照组比较，#：P<0.05；与Co-NPs处理组比较，△：P<0.05。

3 讨 论

钴及其纳米颗粒性质稳定，耐高温和腐蚀，同时还具有高磁性，因而广泛应用于人工合金假体、新能源电池、航空航天以及油漆颜料等多个方面。研究发现，人脑中可以检测出环境中暴露的钴相关纳米颗粒[5]，提示钴及其纳米颗粒可能通过职业暴露[10]、环境暴露[11]、医源性暴露[4]等途径作用于人体，从而发挥其毒性效应。课题组前期的研究发现，Co-NPs可致大鼠神经系统损害效应[9]。为进一步阐明Co-NPs的神经毒性及可能的机制，本研究利用PC12细胞建立Co-NPs暴露的体外模型。PC12细胞源自大鼠的嗜铬细胞瘤，具有神经内分泌细胞的一般特征，同时具有可传代的特点，高度分化的PC12细胞具有神经元的特性，因此，广泛应用于神经生理和神经药理学研究[12]。本研究发现，Co-NPs处理后，PC12细胞发生细胞凋亡，且氧化应激指标改变[13]，表现为GSH-Px生成增多，催化GSH变为GSSH，使前者含量减少；另一方面，Co-NPs也激活了NRF2/HO-1通路，NRF2的表达升高，促进其靶基因HO-1蛋白表达。

钴可引起氧化应激，并激活NRF2相关通路[2]。NRF2发挥着细胞抗氧化的功能，与细胞氧化应激和凋亡密切相关[14]，能够调控一系列抗氧化剂响应元件依赖性基因的基础表达和诱导表达，包括抗氧化剂蛋白和Ⅱ期解毒酶，如HO-1[15]。NRF2调控靶基因参与保护细胞免受氧化剂和炎症性物质的破坏，维持线粒体功能、细胞氧化还原和蛋白质稳态[16]，而NRF2/HO-1作为经典的氧化应激通路[2]，参与多种疾病的发生发展[17]。本研究结果表明，Co-NPs处理后，PC12细胞中MDA、GSH-Px含量升高，而GSH含量降低，说明氧化应激在Co-NPs致PC12细胞损害中发挥作用。此外，Co-NPs处理能够引起PC12细胞NRF2及HO-1蛋白表达增多。NRF2的激活会导致抗氧化剂HO-1的表达增加，其与神经元细胞损伤修复密切相关[18]。采用抗氧化剂暨NRF2激活剂tBHQ处理，发现tBHQ能够缓解Co-NPs引起的细胞毒性，使细胞活性部分回升。上述结果说明，Co-NPs处理PC12细胞后，由于应激，细胞内源性的NRF2/HO-1抗氧化通路被激活，但仍然不足以逆转Co-NPs导致的PC12细胞损伤，导致PC12细胞凋亡。在此基础上，加入tBHQ进一步激活NRF2，可缓解由Co-NPs 引起的PC12细胞活力下降，在Co-NPs处理48 h组中，细胞活力回升更加明显，说明NRF2/HO-1通路的激活可帮助PC12细胞抵御Co-NPs所致的神经损害。

综上所述，Co-NPs能诱导PC12细胞发生凋亡和氧化应激，同时应激性激活NRF2/HO-1信号通路，而NRF2的激活可帮助细胞抵御Co-NPs所致的神经毒性，为Co-NPs暴露引起神经损害的机制研究提供依据。