产卵相关TOR信号通路对蚊虫传病能力的影响

杨适齐 张晏培 蓝睿祺

研究背景及思路

疟疾每年全球范围内导致超过40万人死亡，同时带来约27亿美元的经济损失。疟疾的主要传播媒介是按蚊。按蚊必须吸食至少一种脊椎动物的血液才能启动自身的卵子发生途径。按蚊吸血后数小时内，血液淋巴中的氨基酸水平显著升高，进而激活雷帕霉素靶点（the target of rapamycin，TOR）信号通路。TOR蛋白激活下游靶蛋白S6激酶（S6K），使其磷酸化，经过一系列信号分子，最终刺激蛋白质翻译并启动按蚊卵子发育并产卵。

除了为生殖提供营养外，交叉吸食宿主的血液使按蚊成为疟疾的有效媒介。入侵的疟原虫在感染后数小时内引起按蚊体内基因表达谱的整体改变，特别是免疫相关基因。按蚊免疫系统由体液免疫和细胞免疫組成。疟原虫感染宿主后，会导致其先天免疫系统从基础静止状态到高活性状态的转变，从而引起一系列转录水平和代谢水平的显著改变。由此，感染疟原虫的按蚊对糖类物质和血液中氨基酸摄取量增加，按蚊自身繁殖力反而下降。

按蚊代谢信号通路如何与免疫系统相互作用的机制尚不清楚。已有证据表明，斯氏按蚊（传疟按蚊的一种）TOR信号通路与免疫信号通路之间的交互作用决定其传播疟疾的能力。抑制TOR信号通路能够上调免疫应答，从而增强按蚊对疟原虫感染的抵抗力。

研究过程及结果

研究过程

研究过程及实验方法见图1。

研究结果

TOR信号通路刺激按蚊产卵

血液中的营养物质可以直接激活TOR信号通路，或者通过抑制TOR复合物的负调控因子TSCl，从而间接调控TOR信号通路。继而通过磷酸化下游蛋白S6K，实现对产卵相关蛋白合成的促进。换言之，S6K的磷酸化水平可以被视为TOR信号通路活性的有力检测指标。

疟原虫感染损害按蚊生殖产卵

按蚊在感染疟原虫后生殖能力显著下降。我们首先检测了感染疟原虫后对于蚊虫生殖能力的影响。分别对健康蚊虫喂食了正常小鼠血液及疟原虫感染的小鼠血液，几天后，观察对比2组蚊虫的产卵数目。与对照组相比，喂食疟原虫感染血液使得蚊虫产卵数量显著下降。这一结果也验证了我们实验模型的准确性。那么，抑制按蚊产卵会对疟原虫产生什么影响呢？

雷帕霉素处理会抑制TOR通路，同时增强按蚊对疟原虫感染的抵抗能力

研究疟原虫感染与按蚊产卵关系的第一步，就是研究TOR信号通路对疟原虫感染的影响。已知雷帕霉素是TOR复合物的强抑制剂，我们首先通过对按蚊进行雷帕霉素处理，成功抑制TOR通路。接着使用伯氏疟原虫感染雷帕霉素处理过的按蚊，可以观察到雷帕霉素处理使得S6K激酶的磷酸化水平被显著抑制，证明TOR通路被有效抑制。与此同时，我们也观察到按蚊的中肠段疟原虫卵囊数也明显下降。

基于以上实验结果，我们假设雷帕霉素对于感染的疟原虫没有副作用影响，那么按蚊对于疟原虫感染抵抗能力的显著增强很可能是由于雷帕霉素对于按蚊TOR通路的抑制作用导致的。

RNA干扰会抑制TOR通路，同时增强按蚊对疟原虫感染的抵抗能力

为了进一步深入研究，同时排除雷帕霉素的副作用影响，我们采用双链RNA介导的RNA干扰手段，对TOR基因进行了特异性敲低。敲低处理使得TOR基因表达水平下降了44.5%。与此同时，我们还观察到S6K激酶磷酸化水平显著下降了。相似的，伴随着TOR基因表达水平的下降，RNA干扰也使得按蚊的中肠段疟原虫卵囊数明显下降，对照组中疟原虫卵囊中位数每只按蚊12个，而dsTOR处理后的实验组，平均每只按蚊中肠段中的疟原虫中位数仅有2个。这证明了抑制TOR通路确实可以增强按蚊对疟原虫感染的抵抗能力。

TOR通路的激活会增大按蚊感染疟原虫的可能性

假设TOR通路的抑制会增强按蚊对于疟原虫感染的抵抗能力，那么我们预期，TOR通路活性的增强将会促进疟原虫在按蚊体内的存活。为了检验这一假设是否准确，我们敲低了TOR信号通路的负调控因子——TSCl基因表达水平。通过感染疟原虫，发现S6K激酶的磷酸化水平明显升高，证明TOR通路的活性增强。相应的，TOR通路的活性增强也伴随着按蚊的中肠段疟原虫卵囊中位数明显升高，从对照组的0个/只到实验组的31个/只。

雷帕霉素处理调节按蚊对疟原虫感染的免疫响应

注射雷帕霉素抑制TOR通路后，很多与按蚊免疫响应相关的基因表达显著上调，如TEP1、REL2等。这一结果揭示了TOR通路极有可能与按蚊免疫响应有密切关系。根据研究数据，我们发现雷帕霉素处理使得按蚊TOR通路被抑制，从而使按蚊生殖产卵能力大大下降，与此同时，按蚊对于疟原虫感染的免疫应答能力显著增强。

雷帕霉素处理改变按蚊应对疟原虫感染的免疫基因转录水平

按蚊传播感染疟原虫能力主要取决于一些免疫蛋白，包括TEP1、LRIMl和APLl等。其中，TEP1是主要负责裂解寄生虫卵囊的蛋白质。为了进一步确认按蚊对疟原虫感染的抵抗能力与TEP1蛋白功能之间的关系，我们先特异性敲低了TEP1基因表达水平，接着分析经过雷帕霉素处理后的按蚊疟原虫感染率的高低。我们发现，TEP1的沉默大大削弱了按蚊经雷帕霉素处理引起的疟原虫感染免疫作用。这些结果表明，在按蚊感染疟原虫的过程中，阻遏TOR信号通路会使得按蚊免疫反应在转录水平上有剧烈的改变。也就是蚊虫的产卵生殖能力与其免疫反应作用存在着密切相关、相互影响的联系。

结果与讨论

蚊子通过吸血才能完成产卵等生殖周期。一方面，血液来源和一次吸血总量会影响雌蚊产卵;另一方面，疟原虫进入按蚊肠道后会激发按蚊宿主的免疫反应。而按蚊通过这一系列免疫反应清除入侵的疟原虫防止自身受到伤害。然而，按蚊生殖产卵和免疫反应的激活都需要营养物质。所以，这些营养物质是如何在生殖产卵和免疫反应之间平衡的？另外，能否通过改变营养平衡，在减少按蚊生殖产卵的同时，提高按蚊的免疫反应从而抑制疟原虫繁殖呢？

我们首先通过显微注射药物雷帕霉素于按蚊体内抑制TOR通路。通过Western blot杂交实验证明，雷帕霉素处理能阻遏TOR通路，比如TOR的下游靶蛋白——磷酸化的S6K激酶被显著抑制了。在按蚊产卵能力下降的同时，疟原虫卵囊的数量也相应减少了。

但是，雷帕霉素是直接作用于疟原虫，还是通过抑制蚊虫的TOR通路作用于疟原虫，从而使得卵囊数量减少的呢？我们选择了显微注射靶向TOR基因的双链RNA抑制TOR的表达水平。逆转录PCR的实验结果显示通过RNA干扰，降低了约一半TOR基因表达水平。当然，磷酸化的S6K激酶也被显著抑制了。更进一步的，在按蚊产卵能力下降的同时，疟原虫卵囊的数量也相应减少。

既然抑制TOR通路能显著降低疟原虫数量，那么激活TOR通路对疟原虫数量又有什么影响呢？为此，我们通过显微注射双链RNA的技术敲低TOR的负调控因子TSCl从而激活TOR信号通路。Western杂交实验结果显示，敲低TSCl导致S6K激酶的磷酸化水平显著提高。更重要的是，疟原虫卵囊数量也有明显的增加。

那么，干扰TOR通路之后为什么会导致卵囊数的降低呢？已知TEPl是按蚊清除疟原虫的重要免疫效应分子，所以我们尝试通过注射双链RNA技术敲低TEPl。实验结果表明，无论是在RNA还是蛋白质水平，TEPl都被显著抑制。敲低TEPl后，再用雷帕霉素处理后，我们发现按蚊对疟原虫的易感性上调，这证明干扰TOR通路抑制疟原虫感染确实是通过调控免疫分子实现的。这将为我们把雷帕霉素推向临床，用于按蚊传疟能力防治与控制提供有力的理论依据。