小麦-鹅观草第一部分同源群染色体渗入系鉴定与基因组归属分析

2021-10-18王仪威冯祎高刘润然卢春甜曹爱忠张瑞奇

生物技术进展 2021年5期

王仪威，冯祎高，刘润然，卢春甜，曹爱忠，张瑞奇

南京农业大学农学院，江苏省现代作物生产协同创新中心，南京210095

由禾谷镰孢菌复合种（Fusarium graminearumcomplex）引起的赤霉病是我国小麦生产中一种重要的真菌病害。近年来，由于气候变暖、抗病品种缺乏以及大量秸秆还田等，赤霉病在长江中下游麦区和黄淮麦区频繁发生，已成为小麦主产区的重要病害，严重威胁小麦的安全生产。小麦感染赤霉病后不仅影响产量，而且会使籽粒中产生大量脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等真菌毒素，严重危害人类健康[1]。化学杀菌剂如多菌灵、戊唑醇和氰烯菌酯等被广泛用于小麦赤霉病的防治，但长期使用这些杀菌剂，会造成病菌产生抗药性，严重影响药剂的防治效果。另外，药剂防治不仅增加了小麦生产成本，且对环境也造成污染。因此，培育抗病品种和合理种植布局是控制小麦赤霉病的根本措施。

发掘优异抗性资源及对其抗性进行遗传解析是培育抗病品种的前提。普通小麦经过近万年的人工驯化和育种选择，遗传基础日趋狭窄，抗赤霉病的种质资源相对匮乏，仅有苏麦3号、望水白等少数资源[2-3]。尽管研究者针对小麦抗侵染、抗扩展和低毒素积累性状从小麦种内发现了与赤霉病抗性相关的数量性状位点（quantitative trait locus，QTL）200多个[1]，但大部分位点对赤霉病抗性的贡献较低，需要将多个位点聚合后才能达到中抗以上水平。然而，小麦近缘种保留了丰富的遗传多样性，且对各种生物和非生物胁迫具有良好的适应性，为小麦赤霉病抗性改良提供了优异基因资源。

近年来，国内外针对小麦高抗赤霉病种质资源缺乏问题，已开展了小麦近缘种抗赤霉病资源发掘工作，在大赖草、鹅观草、纤毛鹅观草、长穗偃麦草等近缘种中发掘出一批抗赤霉病的优异种质[1]。通过远缘杂交和染色体工程将赤霉病抗性导入小麦对小麦抗性育种具有重要意义。目前，来自小麦近缘属种的抗赤霉病基因有3个。其中，来自于大赖草的Fhb3定位于（Leymus racemosus）7Lr#1染色体短臂[4]；来自于鹅观草的Fhb6定位于（Roegneria kamoji）1Rk#1染色体短臂[5]；来自于偃麦草的Fhb7定位于（Thinopyrum）7E染色体长臂[6]。这些优异的赤霉病抗性基因，为小麦抗赤霉病育种提供了重要的基因资源。

鹅观草（R.kamojiOhwi，2n=42，SSHHYY）为多年生草本植物，广泛分布于东亚地区。周永红等[7]鉴定了鹅观草属13个种71份材料，结果表明鹅观草属是小麦族中赤霉病抗性最强、抗源最多的一个属。翁益群[8]等对小麦族8个属近20个亲缘种进行接种鉴定发现，鹅观草的赤霉病抗性较好，且通过远缘杂交和幼胚培养，获得了鹅观草与中国春的杂种及回交后代。经过多次回交、自交后，Wang等[9]选育出5个附加系和代换系，经限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）分析，明确附加系NAU701、NAU702和代换系NAU751中鹅观草染色体分别属于第1、第5和第3部分同源群，被标定为1Rk#1、5Rk#1和3Rk#1。汪杏芬等[10]选育出赤霉病抗性较好的1Rk#1（1A）异代换系。此后，美国堪萨斯州立大学Cainong等[5]从南京农业大学引进1Rk#1渗入系材料，利用中国春ph1b1b突变材料诱导染色体重组，创制出了T1AL·1AS-1Rk#1S小片段易位系，通过赤霉病抗性鉴定，将该易位系携带的抗赤霉病基因定名为Fhb6。由于鹅观草基因组的核型分析尚不能区分每条染色体的基因组归属，因此，携带Fhb6基因的染色体基因组归属目前还不清楚。

目前，许多外源物质鉴定新方法和技术的出现和发展使得快速鉴定和精确识别外源染色体身份成为可能。为了发掘鹅观草基因组中更多优异的赤霉病抗源，南京农业大学细胞遗传所2010年重新开展了中国春与鹅观草远缘杂交研究[11]。通过多年回交、自交，获得了鹅观草不同染色体渗入到中国春背景的细胞学材料。本研究基于渗入系材料，欲筛选鹅观草第一部分同源染色体特异分子标记，并进一步利用分子标记对携带Fhb6染色体进行基因组归属分析，筛选鉴定鹅观草第一部分同源群不同染色体渗入系材料，为后续鹅观草第一部分同源群染色体上赤霉病抗性基因的发掘奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鹅观草NAURK01采自南京农业大学江浦试验田自然生长的鹅观草。为区分1989年与中国春杂交的鹅观草，将重新杂交鹅观草NAURK01的染色体编号为#2，早期杂交的鹅观草染色体编号为#1。携带抗赤霉病基因Fhb6的二体异代换系材料DS1RK#1(1A)用于分析携带Fhb6染色体的基因组归属。另外用于鹅观草染色体基因组归属分析的小麦野生近缘属种包括黑麦（Secale，RR）、大麦（H.vulgare，HH）、老芒麦（E.sibiricus，SSHH）、二倍体拟鹅观草（P.libanotica，SS）、加拿大披碱草（E.canadensis，StStHH）和纤毛鹅观草（R.ciliaris，SSYY）。以普通小麦中国春和安农8455作为对照。上述材料均由南京农业大学细胞遗传研究所保存提供。

1.2 细胞学鉴定

将试验材料种子按单粒编号、浸种、发芽，待幼根长至2 cm左右，将种子移至盛有0.2 μmol·L-1甲基胺草磷（amiprophos methyl，APM，溶剂为丙酮）溶液的培养皿中浸泡2 h，再用清水冲洗后将根剪下，放入0.5 mL离心管（管盖上扎一小孔）。随后将离心管放入密封的笑气罐中，充入压强为0.8～1.2 MP的笑气（N2O），1.5 h后取出，加入90%预冷冰乙酸固定8 min后将根取出，经滤纸吸干放入新的1.5 mL离心管，加入适量70%的乙醇，保存于-20℃冰箱备用。用45%醋酸溶液解离根尖，取分生区细胞以压片法制片。将制好的片子放入-70℃冰箱，充分冷冻后，揭去盖片放入无水乙醇中脱水5 min以上，气干后用于原位杂交。

基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，GISH）探针和重复序列寡聚核苷酸探针混合荧光原位杂交（Oligo-fluorescence in situ hybridization，Oligo-FISH）具体操作步骤参照王丹蕊等[12]方法进行。纯化后的鹅观草基因组DNA用Fluorescein-12-dUTP（Roche）经缺刻平移法标记后用作GISH探针。使用的重复序列寡聚核苷酸探针为小麦D基因组染色体转化的pAs1-2和pAs1-5，用红色荧光素TAMRA 5′端标记，探针序列和荧光标记由安徽通用生物系统公司合成。GISH和Oligo-FISH分析时每张制片的杂交液中探针用量为：鹅观草基因组GISH探针2 μL，重复序列寡聚探针pAs1-2和pAs1-5各加1 μL。进行杂交时封阻用的中国春基因组DNA与鹅观草基因组GISH探针的浓度比为100∶1。原位杂交制片在OLYMPUS BX53型荧光显微镜下选取染色体完整、分散良好的有丝分裂中期细胞，用DP80 CCD(Cooled Color Digital Camera)和cellSens Standard 1.18成像系统（OLYMPUS）拍照，利用Adobe Photoshop（v6.0）软件进行图片分析。

1.3 分子标记鉴定

CTAB法提取植株叶片DNA[13]。从已定位于小麦第一群染色体臂的特异EST-STS标记中筛选鹅观草第一部分同源群染色体特异标记[14-16]，标记信息详见表1。PCR扩增反应体系为10 μL，包含2×TaqTSINGKE Master Mix（green，购自北京擎科生物科技有限公司）5 μL，DNA模板（浓度约120 ng·μL-1）1 μL，引物各0.2 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 3.6 μL。然后加入7 μL石蜡油进行液封，防止DNA在PCR过程中挥发。800 r·min-1离心20 s，取出后缓慢颠倒，使各成分充分混匀。PCR程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸50 s，33次循环；72℃延伸10 min；4℃保存。8%的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳检测PCR产物，1%硝酸银染色。

表1 鹅观草第一部分同源群染色体特异分子标记Table 1 Specific molecular markers of homologous group chromosomes1 in R.kamoji

2 结果与分析

2.1 鹅观草第一部分同源群染色体特异分子标记筛选

利用45个标记对鹅观草NAURK01及携带Fhb6的小麦-鹅观草异代换系DS1RK#1(1A)进行扫描，有20个标记能够鉴定出鹅观草第一部分同源群1条或多条染色体，但多数标记在鹅观草与普通小麦中扩增产物的分子量大小较接近。其中，CINAU27、CINAU190、CINAU207和CINAU493在普通小麦中国春和安农8455均能扩增出1A、1B和1D特异条带，同时能够鉴定鹅观草第一部分同源群2条或3条染色体，且PCR产物与小麦第一部分同源群染色体扩增产物易于区分，因此，选取这4个STS标记用于后续材料鉴定（表1）。其中，CINAU27在鹅观草中扩增出两条特异条带，其余3个标记在鹅观草中扩增出3条特异条带(图1，2)。CINAU493定位于小麦第一部分同源群染色体长臂，其余3个标记定位于小麦第一部分同源群染色体短臂。

2.2 携带Fhb6染色体的基因组归属分析

利用CINAU27对小麦近缘物种中可能是鹅观草基因组供体的二倍体或四倍体种进行鉴定，结果（图1）表明，除大麦（HH）外，该标记在供试材料中均扩增出特异条带，表明该标记序列在小麦近缘物种中存在同源序列，可用于基因组进化分析。CINAU27在六倍体鹅观草（SSHHYY）和四倍体纤毛鹅观草（SSYY）扩增出了两条分子量大小相同的条带，一条分子量为930 bp，另一条分子量为590 bp。在四倍体老芒麦（SSHH）和二倍体拟鹅观草（SS）中仅扩增出了590 bp特异条带。因此，CINAU27在六倍体鹅观草中扩增出的590 bp特异条带应为1S特异条带，930 bp特异条带应为1Y特异条带。携带Fhb6小麦-鹅观草异代换系DS1RK#1(1A)DNA仅出现930 bp特异条带，缺失1A染色体特异条带（图2a），由此推断，该小麦-鹅观草异代换系为DS1Y#1（1A），Fhb6基因所在的染色体为1Y#1。

图1 分子标记CINAU27在普通小麦及其近缘属种PCR扩增产物Fig.1 PCR productions amplified by marker CINAU27 in wheat and its relatives

2.3 小麦-鹅观草第一部分同源群染色体渗入系材料分子细胞学鉴定

从中国春与NAURK01的BC2F6世代中共计选育出5份材料涉及鹅观草第一部分同源群染色体，分别命名为21RK-1、21RK-2、21RK-3、21RK-4和21RK-5。利用筛选的鹅观草4个特异STS标记对5份材料进行PCR，结果（图2）表明，21RK-1的4个STS标记扩增产物与携带Fhb6小麦-鹅观草异代换系DS1RK#1(1A)完全相同；与中国春相比，多一条1Y染色体特异条带，而缺少1A染色体特异条带。21RK-2与中国春相比，CINAU27的扩增产物多一条1S染色体特异条带，而缺少1D染色体特异条带。21RK-3、21RK-4和21RK-5扩增的鹅观草特异条带与21RK-2相同，表明均是涉及1S#2染色体的渗入系材料。但21RK-5在用CINAU493扩增时缺少鹅观草特异条带，表明该材料包含的染色体是1S染色体短臂。

图2 基因组特异分子标记在5份小麦-鹅观草渗入系材料的PCR扩增结果Fig.2 PCR productions of five wheat-R.kamoji introgression lines amplified by using four STS markers

基因组原位杂交和oligo-FISH鉴定发现（图3），21RK-1的染色体数目2n=42，包含一对鹅观草染色体（图3B），其Oligo-FISH核型与1Y#1相同（图3G），因此，21RK-1是1Y#2染色体代换1A染色体的二体异代换系DS1Y#2(1A)。21RK-2的染色体数目2n=42，包含一对鹅观草染色体且其oligo-FISH核型与1Y染色体不同（图3G），且缺少一对1D染色体（图3C），因此，21RK-2是1S#2染色体代换1D染色体的二体异代换系DS1S#2（1D）。21RK-3是添加1S#2染色体的异附加系DA1S#2（图3D）。21RK-4为1S#2和TW·1S#2S的双单体附加系（图3E）。21RK-5为纯合TW·1S#2S易位系（图3F）。

图3 小麦-鹅观草渗入系材料的GISH/FISH分析Fig.3 GISH/FISH analysis of six wheat-R.kamoji introgression lines

3 讨论

小麦野生近缘属种包含大量的异源多倍体，这些异源多倍体基因组的二倍体供体鉴定是一项复杂的工作。传统的异源多倍基因组组成分析主要依靠染色体核型分析，或将异源多倍体与不同二倍体杂交后对其杂种F1花粉母细胞减数分裂染色体进行构型分析。鹅观草是异源六倍体（2n=2x=42，SSHHYY），染色体较多，要获得一套以普通小麦为背景的完整鹅观草添加系/代换系是一项长期工作，并且鹅观草染色体组的核型难以区分每一条染色体，因此，小麦-鹅观草染色体渗入系的鉴定具有巨大挑战。南京农业大学细胞遗传研究所早在20年前就选育出了抗赤霉病较好的二体异代换系材料DS1RK#1(1A)[8-10]，将其携带的抗赤霉病基因命名为Fhb6[5]，但一直无法确定携带该基因染色体的基因组归属。本研究通过筛选小麦及其近缘属种第一部分同源染色体特异分子标记，明确了携带抗赤霉病基因Fhb6的染色体为1Y染色体。利用这些标记从中国春与鹅观草的渗入系中鉴定出了5份涉及鹅观草第一部分同源群染色体的新种质。本研究结果表明，基因组特异分子标记为精确、高效鉴定小麦-鹅观草渗入系提供了新策略，加快了鹅观草中优异抗性基因的发掘工作，对小麦与其他野生近缘种的远缘杂交工作具有借鉴作用。

小麦及其近缘属种赤霉病抗性遗传分析表明，高抗病材料往往包含多个抗病基因。异源六倍体鹅观草是抗小麦赤霉病最强的野生近缘属种，可能也是多个抗性基因聚合的效应。本实验室对鹅观草与普通小麦杂种后代的赤霉病抗性鉴定发现，中国春与鹅观草杂种F1及回交BC1F1和BC2F1后代的赤霉病抗性较高[11]，但总体上随着回交和自交代数增加呈下降趋势。这可能是随着世代增加，携带多条鹅观草染色体的单株逐步被淘汰，每个植株(系)中只保留1～2条外源染色体，因此，推测鹅观草抗小麦赤霉病基因可能位于不同染色体。从鹅观草1Y染色体短臂末端定位到一个赤霉病抗性位点Fhb6，与其部分同源的第一部分同源群其他染色体上也可能存在Fhb6等位基因。本研究从中国春与鹅观草重新杂交的后代中选育到新的1Y#2（1A）二体异代换系，还选育到4个与其部分同源的1S#2染色体渗入系材料。这些材料为进一步发掘Fhb6等位基因奠定了基础。尽管对这些材料还未进行系统的赤霉病抗性鉴定，但多年的自然发病观察发现携带1S#2染色体的21RK-2和21RK-3抗性较好，可能携带新的赤霉病抗性位点，生育期较中国春早，穗型与中国春不同，短芒且育性好（图4）。DS1S#2（1D）二体异代换系材料21RK-2与感赤霉病优质高产品种安农8455杂交获得了1S#2与1D双单体材料，后续将进一步从其自交后代材料中鉴定1DL.1S#S和1DS.1S#L补偿性易位系，系统分析安农8455遗传背景下易位系的赤霉病抗性和农艺性状，为小麦抗赤霉病育种提供新种质。