一株能产高温纤维素分解酶的低温菌对玉米秸秆的降解

2021-10-18魏素珍金晓丽张延蕾

饲料工业 2021年18期

■魏素珍金晓丽张延蕾

（西藏农牧学院资源与环境学院，西藏林芝 860000）

玉米秸秆的产量在我国大部乃至西藏地区都是非常高的，秸秆中富含的纤维素、半纤维素等物质具有重要的使用价值，是一种巨大的资源，将其直接舍弃是对资源的浪费，也会造成环境的污染。目前玉米秸秆在我国主要用作牲畜饲料、直接还田或堆肥发酵后还田等[1]。在玉米秸秆的各种应用中几乎都涉及了秸秆的生物分解。然而由于纤维素、半纤维素和木质素等成分的降解需要专门酶的参与，并且各成分之间相互缠绕、渗透，并不利于微生物的分解[2]。虽然自然环境中广泛存在着纤维素分解菌，但对于一些特殊环境，比如高温堆肥或冬季低温下的秸秆分解，自然环境中其降解状况往往不理想，需要添加高活性的纤维素分解酶以提高其降解性能[3]。因此，从野外环境中寻找具有能在特殊环境下发挥活性的纤维素分解菌对于各种情形下的秸秆降解是非常必需的，也是目前各国学者竞相研究的热点[4-5]。

自然环境中能够降解纤维素的微生物种类是非常多的，包括有真菌、细菌、放线菌等[6]。这些微生物有的是厌氧的、有的是好氧的、有的是喜高温的、有的是喜中温的、也有的是耐低温的，但是大部分所产纤维素酶的活性都是非常低的，只有少数微生物所产的纤维素酶活性达到工业生产的要求[7]。因此，寻找高活性的纤维素酶生产菌株对于工业纤维素酶的生产具有非常重要的意义。通常低温微生物可以产生各种低温活性的酶类，而高温酶则通常是由喜高温微生物生产的。本研究通对从西藏各种环境如农田土壤、林地土壤、草地土壤以及枯枝落叶中进行嗜低温纤维素分解菌种的筛选，获得了一株能产高温纤维素酶的耐低温菌，该菌株有望能用于堆肥、青贮饲料或者反应温度跨度较大的环境中。为了研究该菌株对玉米秸秆的降解情况，本研究用该菌株及其所产的CMC酶分别对玉米秸秆进行处理，考察了菌株与其粗酶液在不同条件下对玉米秸秆的处理效果，其研究结果可为该菌株在各类木质纤维素类废弃物的资源化利用方面提供参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 试验材料

用以分离和筛选纤维素分解菌种的土壤样品或腐烂的木质材料均采自西藏农牧学院的校园。西藏农牧学院位于西藏林芝市，平均海拔3 000 m。

纤维素分解菌分离培养基：2 g/L (NH4)2SO4、0.5 g/L MgSO4、2 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L NaCl、2 g/L CMC-Na和15 g/L琼脂。

纤维素分解菌生长培养基：2 g/L(NH4)2SO4、0.5 g/L MgSO4、2 g/L KH2PO4、1 g/L K2HPO4、0.5 g/L NaCl、20 g/L CMC-Na、2 g/L酵母粉。

CMC粗酶液：将生长至对数期的纤维素分解菌培养液在10 000 r/min 下离心10 min，其上清液用作粗酶液。

玉米秸秆采自西藏农牧学院农场，将收获玉米后的秸秆在野外自然晾干后粉碎过直径约为1 mm的筛子后备用。

1.2 菌株的分离与鉴定

将1 g土壤样品或腐烂的木质材料加入100 mL已灭菌的生理盐水（0.85% NaCl）中，室温下振荡30 min，将0.1 mL 的上清液涂布在含有分离培养基的培养皿中，置于15 ℃进行低温纤维素分解菌种的筛选。待平皿上出现肉眼可见的菌落后用碘液进行染色，根据菌落周围水解圈的大小初步判断所获得菌种分解纤维素能力的大小[8]。将有明显水解圈的菌株挑出进一步进行分离纯化。将所获得的纯菌株点接种于含有CMC-Na 的培养皿中分别置于0、4、10、15、20、25、30 ℃和35 ℃的培养箱中，培养7 d 后将培养皿取出，根据菌落直径大小进行菌种最适生长温度的确定。每组试验设置3个重复。

根据菌落的形状、颜色，菌丝的形态，孢子的形状、颜色、大小及ITS 基因序列进行菌种鉴定[9]。通过PCR 扩增后对菌株的ITS 序列进行测序，将所获得的基因序列提交至National Center for Biotechnology In⁃formation（NCBI）数据库进行比对[10]，使用MEGA 7.0软件将所获得的相似序列通过邻接法（neighbor-join⁃ing method）构建进化树。

1.3 菌株所产CMC酶性质分析

菌株所产CMC 酶最适反应温度的测定是将粗酶液与1% CMC-Na（W/V）在pH 4.0的缓冲液中保温30 min 后进行测定，所选温度范围为10～90 ℃，其中10～60 ℃按照每10 ℃间隔递增，60～90 ℃按照5 ℃的间隔递增。最适pH 的测定是将粗酶液与不同pH（2.2、3、4、4.6、5、6、7 和8）的缓冲溶液在70 ℃的条件下进行保温测得，缓冲溶液是由磷酸氢二钠（Na2HPO4）和柠檬酸按照不同的配比配置而成。酶的热稳定性试验是将粗酶液预先在50、60 ℃和70 ℃的水浴锅中分别放置0.5、1、2、4 h 和10 h，然后在pH 4.0 和70 ℃的条件下测其剩余酶活性。

1.4 菌株对玉米秸秆的处理

将分离获得的纯菌株接入干物质（TS）含量分别为20%、25%、30%、35%、40%即水含量分别为80%、75%、70%、65%、60%的灭菌玉米秸秆中，其中将秸秆调制成不同含水状态所用的液体为纤维素分解菌生长培养基的无机盐溶液。接菌后在20 ℃恒温条件下培养至6 d和10 d后取出秸秆测其可溶性物质含量以及秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的残余量。其中培养至6 d 时菌株有大量菌丝生成，仅有很少量的颜色改变即孢子的生成；培养至第10 d时菌体颜色几乎全部变为绿色，即有大量的孢子生成。

1.5 纤维素酶粗酶液对玉米秸秆的处理

将纯菌株接种于生长培养基中进行培养，待生长至对数期时停止培养，收集发酵液并滤去菌体，在发酵液中添加Na2HPO4和柠檬酸使其pH 为4.0，该发酵液即为菌株的粗酶液。将部分玉米秸秆在121 ℃进行20 min湿热灭菌处理，以未灭菌处理的秸秆为对照组，加入调节pH后的粗酶液使TS的含量分别为15%、20%、25%和30%。然后在60 ℃的条件下处理12 h后测秸秆含水率、秸秆灭菌与否对处理效果的影响。

1.6 分析检测方法

可溶性化学需氧量（SCOD）是采用0.45 μm 的膜过滤上清溶液，按照连华科技仪器使用说明书进行化学需氧量的测量获得。纤维素、半纤维素、木质素的测量见参考文献[11]。TS 的获得采用105 ℃烘干至恒重的方法[12]。秸秆中水不溶性物质的测量方法为：称取1 g 干秸秆置于0.45 μm 的膜上，用纯化水浸泡30 min 并反复清洗后称量干重获得。秸秆中水溶性物质的量为秸秆总重去除水不溶性物质后获得。CMC酶活性测量方法采用DNS方法进行[13]，每分钟水解底物产生1 μg葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，用U表示。

2 结果与分析

2.1 菌株Penicillium sp. SW-3的分离鉴定及性质

通过在低温(15 ℃)条件下进行纤维素分解菌种的分离，共获得十余株可以在低温条件下进行良好生长的纤维素分解菌种。对其中一株水解圈较大的菌株进行了分类鉴定以及性质分析，该菌在显微镜下的菌丝照片如图1a所示，该菌在固体培养基上呈毛绒状，暗绿色，孢子呈球状，具有扫帚状的分生孢子梗。用真菌5-18S的ITS基因测序结果表明，该菌株与Penicilli⁃umsp. AP-2015（Gen bank No.KT898129.1）具有极高的相似性（图1b），因此根据其菌丝特点以及ITS鉴定结果判断该菌为青霉属的一株真菌，命名为Penicilli⁃umsp. SW-3，其ITS 基因存放在NCBI 核酸数据库中（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），编号为MK418985。对该菌生长温度范围的研究结果表明，Penicilliumsp.SW-3 的最适生长温度为20 ℃，在0～30 ℃的范围内都可进行生长（图1c），超过30 ℃该菌不能生长，但在0 ℃可以缓慢生长。根据微生物的生长温度范围可知，该菌不是严格意义上的低温菌，只能是一株耐低温的菌株[14]。

图1 菌株Penicillium sp. SW-3的鉴定及性质

温度和pH 对Penicilliumsp. SW-3 所产CMC 酶酶活性的影响如图2 所示。在pH 2.0～7.0 范围内，该酶可以发挥活性，其最适酶反应pH 为4.0（图2a），表明该菌株所产的CMC 酶是一种酸性纤维素酶，类似于文献中报道的多数纤维素酶[15-16]。然而值得注意的是Penicilliumsp. SW-3 所产的CMC 酶具有较宽的温度作用范围，在10～90 ℃范围内都可以发挥活性，其最高酶活性温度为70 ℃，并且在较低的温度下（20～50 ℃）也具有较高的活性（图2b）。当在最适反应pH 4.0 以及温度为70 ℃时可以获得最高的酶活性即92.4 U/mL。对该酶的热稳定性分析试验表明，在外界温度不高于60 ℃时，该酶的热稳定性是非常高的（图2c），当在50 ℃和60 ℃时分别保温10 h 后，该酶的残余酶活性依然具有原来的95%和89%。虽然该酶的最高活性温度为70 ℃，但在70 ℃时该酶的酶活性并不稳定，当在70 ℃保温10 mim 后，其活性下降至原来的50%，保温1 h 后，其活性下降至原来的11%。根据Bruins 等[17]对酶功能的分类可知，Peni⁃cilliumsp. SW-3 所产的CMC 酶是一种高温酶。由于该酶在70 ℃时不是很稳定，因此当该酶需要在长时间内（超过30 min）发挥活性时，其反应温度不宜超过60 ℃。

图2 菌株Penicillium sp. SW-3所产CMCase酶性质分析

2.2 玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3 处理前后性质变化

玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3处理6 d和10 d 后水溶性物质和水不溶性物质含量如图3 所示。由图3 可知，与未处理组相比，处理6 d 和处理10 d后水不溶性物质都有所增加，而水溶性物质都有所减少。这一结果表明，在使用菌株Penicilliumsp.SW-3 处理过程中，玉米秸秆中原有的水溶性物质被菌株Penicilliumsp. SW-3大量消耗，同时由于菌丝体的生长导致不溶性物质有所增加。比较6 d和10 d处理组可知，随着处理时间的延长，水溶性物质的量略有减少而不溶性物质则略有增加。比较不同含水条件下的处理结果可知，同一处理时间下，不同含水处理组中的水不溶性物质和水溶性物质含量几乎没有差异，这一结果表明，在水含量为60%～80%时，水分含量的高低对菌株Penicilliumsp. SW-3 的生长没有显著影响，考虑到实际的应用以及后处理情况，在水含量为60%，也即TS 含量为40%时即可。对玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3处理后溶液中的SCOD分析进一步证实了以上的试验结果（图4）。与未处理组相比，不同含水条件下的处理组中SCOD 的含量都明显降低并且相互间没有明显差异。

图3 不同含水条件下玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3处理后水不溶性物质与水溶性物质的变化

图4 不同含水条件下玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3处理前后SCOD的变化

玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3 处理前后每克干物质中灰分、木质素、半纤维素和纤维素的含量如图5 所示。由图5 可知与处理前相比，秸秆中的纤维素、半纤维素都有明显的降低，这表明菌株Peni⁃cilliumsp. SW-3不但可以降解玉米秸秆中的纤维素，还能降解半纤维素。此外，图5 还表明，降解后秸秆中的木质素含量看上去增加了。这可能是由于木质素较半纤维素和纤维素更难降解，反应器中的木质素净含量可能并没有改变，但由于半纤维素和纤维素含量的降低因此导致木质素的含量看上去有些增高。比较各处理组可以看出，各处理组中灰分、木质素、半纤维素和纤维素的含量并没有明显的差异，这表明处理组中的含水量高低对处理结果的影响并不大。由于秸秆类废弃物本身是一类水含量很少的物质，用菌株Penicilliumsp. SW-3 进行处理不必额外添加大量的水，在干物质含量为40%即含水量为60%的条件下可以获得满意的处理效果。这对实际的应用是非常有意义的，不但可以减少水的使用量、并因此减少占地面积，同时对处理后残余物的最终处理处置也是非常有意义的。

图5 不同含水条件下玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3处理前后木质纤维素类成分的变化

2.3 玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3 的粗酶液处理前后性质变化

玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3 的粗酶液处理前后不溶性物质与水溶性物质的变化如图6 所示。由图6 可知，与对照组相比，灭菌组与未灭菌组经菌株Penicilliumsp. SW-3 的粗酶液处理后水不溶性物质都有所减少，而可溶性物质都有所增加，这一结果表明经菌株Penicilliumsp. SW-3 的粗酶液处理后玉米秸秆中的不溶性物质确实被降解了。比较灭菌组和未灭菌组可知，使用菌株Penicilliumsp. SW-3的粗酶液对秸秆进行处理可以不用对秸秆进行灭菌处理，这对秸秆的实际处理应用是非常有意义的。此外，比较图6 中不同含水条件下的处理结果可知，在TS为10%～30%时，含水率的高低对处理结果没有显著影响，考虑到实际生产中的应用操作条件，在TS为30%即含水率为70%时可满足处理要求。对玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3 的粗酶液处理后溶液中的SCOD 的分析进一步证实了以上的试验结果（图7）。

图6 玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3的粗酶液处理前后水不溶性物质与水溶性物质的变化

图7 玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3的粗酶液处理前后SCOD的改变量

玉米秸秆经菌株Penicilliumsp. SW-3 的粗酶液处理前后每克干物质中灰分、木质素、半纤维素和纤维素的含量如图8所示。由图8可知与处理前相比，秸秆中的纤维素、半纤维素都略有降低，与菌处理组相比，粗酶液处理组中纤维素、半纤维素的降低量不如菌处理组明显（见图5和图8），这可能是由于菌处理组的反应时间远长于酶处理组所致。比较玉米秸秆灭菌与否、含水率高低对处理结果的影响可知，各处理组中灰分、木质素、半纤维素和纤维素的含量并没有明显的差异，这表明处理组中的含水量高低以及秸秆灭菌与否对处理结果的影响并不大。这一结果进一步表明在TS为30%即含水率为70%的条件下即可满足处理要求。

图8 玉米秸秆经菌株Penicillium sp. SW-3的粗酶液处理前后木质纤维素成分的变化

3 讨论

目前，高温纤维素酶几乎都是由高温菌产生的，仅发现少数可以从中温菌中获得。比如Liu等[18]从一株中温真菌Fusarium oxysporumL19中获得了一种高温纤维素酶，该酶最适反应温度为75 ℃，在70 ℃时其半衰期只有15.1 min。目前还没有有关从低温菌中发现高温纤维素分解酶的研究报道。但在其他酶中却存在相似的现象，比如一种活性温度范围为0～85 ℃，最适活性温度为70 ℃，依赖NAD+的乙醇脱氢酶被发现产自于一株耐低温菌Flavobacterium frigidi⁃marisKUC-1，该菌的生长温度范围为2～26 ℃[19-20]。另一个例子来自一种卤酸脱卤酶（L-haloacid dehaloge⁃nase），该酶产自于海洋低温菌Psychromonas ingraha⁃mii并具有中温酶的特性，最适酶反应温度为45 ℃，在65 ℃保温90 min后仍具有原酶活性的70%[21]。从进化的角度来看，微生物菌株倾向于改进自身的大分子物质包括各种酶以适应它们周围的环境。然而由于野外的环境条件通常受制于多种因素（比如人类的活动等），不同物种的进化速度是不同的。野外环境中的菌株可能还没有完成自身的进化过程便被研究人员获得，因此研究人员可以通过比较菌株的性质特点获得一些进化的信息。Penicilliumsp. SW-3是目前发现的第一个能够产高温纤维素分解酶的低温菌株，其独特的性质特点对工业生产、有机废弃物的堆肥处理以及研究生命的进化理论都具有非常重要的意义。

用纤维素分解菌纯菌株或酶制剂对天然的纤维素材料进行处理通常需要对材料进行灭菌，这是由于材料中存在的土著微生物会分解利用纤维素酶水解产生的还原性糖类物质[22]。此外，由于菌株自身的生长繁殖也需要消耗所产生的糖类物质，因此为获得较好的处理效果需要充分考虑处理的时间[2]。处理时间过长会导致营养物质的大量消耗，而处理时间过短则达不到处理的要求。本研究结果也表明随着处理时间的延长，Penicilliumsp. SW-3所消耗的可溶性物质量也在增加。此外，由于Penicilliumsp. SW-3 所产的CMC酶是一种高温酶，可以在大于60 ℃的条件下稳定发挥活性，而通常在该温度下能够进行正常生长繁殖的微生物种类是较少的，因此处理过程中不对材料进行灭菌处理并不会对处理结果产生明显的影响。综上可知，用Penicilliumsp. SW-3菌株或酶液对玉米秸秆进行处理各有优缺点，用菌株进行处理需要将材料预先进行灭菌处理，并需要严格控制菌株的生长时间；而用酶液处理虽不需要对材料进行灭菌但需要提前获得大量的酶液并在整个处理过程中维持较高的温度。此外，需要注意的是，由于本处理所用时间较短或者所使用的粗酶液酶效价较低，酶处理结果仍不是十分理想，因此在将来的研究中通过延长酶处理时间或在处理过程中补充酶量也许可使处理效果达到预期值。