纳米银对人骨髓间充质干细胞增殖和凋亡的影响

赵忠福，李晓光，邹德勋，孙兰春，姚宏波

（1.齐齐哈尔医学院附属第二医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006）

0 引言

骨关节假体、支架材料等植入物感染给患者带来严重后果[1]。细菌耐药性持续加剧，生物材料感染率日趋增高[2]。纳米银（Silver nanoparticles，AgNP）能够释放Ag2+，抑制微生物或抑制能量传递[3]，具有抑制细菌、真菌和病毒等活性[4]，被应用于生物材料、医用材料涂层等领域[5]。以AgNPZnO 复合物在骨科植入物表面涂层，能够有效降低感染，扩大了骨科器械的应用，促进了医疗技术的进步[6]。骨髓内含有大量骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC），BMSC 能够分化为骨或软骨，促进骨组织修复和骨折愈合[7]。体外实验发现，BMSC 中添加AgNP，可以促进BMSC成骨分化[8]。虽然AgNP 对BMSC 具有促进分化，抑制细胞感染的作用，但是AgNP 对BMSCs 增殖或凋亡是否产生影响，还鲜见报道。阐明AgNP 对BMSC 增殖、凋亡的影响效果，能够为纳米银在临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

hBMSCs 购自美国ATCC 公司。α-MEM 培养基、胎牛血清购自Hyclone 公司；直径10nm 银纳米溶液、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）均购自Sigma 公司；CCK-8 试剂购自日本同仁公司；Triciribine（Akt 抑制剂）购自美国Selleck 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒等Western blot 试剂购自上海碧云天生物科技有限公司；人Total-SOD 和MDA 的ELISA 试剂盒均购自美国R&D 公司；小鼠抗人Caspase 3 抗体、小鼠抗人GAPDH 抗体和辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG 购自英国Abcam 公司。美国Molecular 公司的Spectra Max190 酶标仪；美国BD 公司的FACSAria Ⅱ流式细胞仪；日本Olympus 公司的IX53 型倒置荧光显微镜。上海天能科技公司的Tanon 6200 发光成像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 BMSC 培养及实验分组

本实验得到齐齐哈尔医学院附属第二医院医学伦理委员会审核并批准。BMSC 用含10%胎牛血清的α-MEM 培养基进行培养。正常培养条件下，无任何刺激培养的BMSCs 为对照组，以5μmol/L AgNP 刺激BMSC 则为AgNP 组；若同时以5nmol/L Triciribine和5μmol/L AgNP 培养的BMSCs 则为Akt 抑制剂组。

1.2.2 CCK-8 实验

1.0×104BMSCs/孔，加入96 孔细胞培养板每孔中，37℃，5%CO2培养12h 后，每孔再添加10μL CCK-8 试剂，继续培养4h。Spectra Max190 酶标仪在450nm 波长检测各组BMSC 的吸光度值（Absorbance value，A 值）。

1.2.3 Western blot

6.5×106各组BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，12000r/min 离心5min，40μg 各组BMSCs 蛋白，100V，经SDS-PAGE 电泳90min，转至PVDF 膜；5%脱脂奶粉封闭60min；分别加入小鼠抗人Caspase 3抗体（1:300），小鼠抗人GAPDH 抗体（1:500），4℃孵育18h；加入HRP 标记山羊抗小鼠IgG（1:400），室温孵4h；ECL 发光剂标记蛋白条带，Tanon 6200发光成像分析系统显影，IPP6.0.1 软件分析蛋白条带的相对表达情况。

1.2.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）

6.5×106各组BMSCs 用RIPA 裂解液裂解。4℃，10000r/min 离心5min，取上清液，人ELISA 试剂盒检测各组BMSCs 的Total-SOD、MDA 蛋白的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 AgNP 对BMSCs 增殖的影响

对照组、AgNP 组、Akt 抑制剂组BMSCs 的A 值分别为（1.68±0.81）、（2.94±0.13）、（1.71±0.44），三组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。AgNP组BMSCs 的A 值是对照组的1.75 倍（P<0.01），Akt 抑制剂组BMSCs 增殖A 值是AgNP 组的58.16%（P<0.01）。

2.2 AgNP 抑制Caspase 3 蛋白表达

对照组、AgNP 组、Akt 抑制剂组BMSCs 的Caspase 3 相对表达量分别为（0.89±0.07）、（0.43±0.01）、（1.01±0.20），组间比较，差异有统计学意义（P<0.01），AgNP 组Caspase 3 蛋白相对表达量是对照组的48.33%（P<0.01）。Akt抑制剂组Caspase 3 相对表达量是AgNP 组的2.34倍（P<0.05），见图1。

图1 Western blot 检测各组BMSCs 的Caspase 3 蛋白表达条带

2.3 AgNP 对Total-SOD、MDA 蛋白的影响

对照组、AgNP 组、Akt 抑制剂组BMSCs 的Total-SOD、MDA 比较，差异有统计学意义（P<0.01）。AgNP 组BMSC 的Total-SOD、MDA 分别是对照组的1.57 倍、77.20%（P<0.01）；Akt 抑制剂组Total-SOD、MDA分别是AgNP组的65.38%、1.24倍（P<0.01），见表1。

表1 各组BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表达（，n=18）

表1 各组BMSCs 的Total-SOD 和MDA 表达（，n=18）

注：*P<0.01，与对照组比较；#P<0.01，与AgNP 组比较

3 讨论

研究发现，颗粒直径10nm 的AgNP 能够形成较大表面积，有利于释放Ag2+，因此，AgNP 比Ag2+具有更显著的杀菌或抑菌效果[9]。AgNP 在医疗植入物表面形成抗微生物涂层，能够有效防止形成微生物膜[10]。抗微生物植入材料具有出色的生物相容性是临床应用，减少副作用，避免感染的基本前提。为了模拟体内炎症环境，我们利用CCK-8 实验观察对照组、AgNP 组和Akt 抑制剂组BMSCs 的增殖情况，相对于对照组，AgNP 组的BMSCs 的A 值增高，提示AgNP 促进BMSC 增殖能力。这可能由于AgNP 具有较好的抗氧化、抑菌等能力，提高了细胞表达抗氧化酶[11]，但是相关实验还需要深入验证。AgNP 组Caspase 3 蛋白表达降低也验证AgNP 对BMSC 具有抗氧化，抑制自由基损伤功能[12]。为了验证我们的判断，以ELISA 实验证明了AgNP 组Total-SOD 蛋白高表达，Total-SOD 有效抵抗缺氧、炎症等原因产生的自由基[13]，修复受损的细胞膜脂质或细胞内DNA 分子，降低细胞内过氧化氢含量，达到抗自由基逆转组织损伤的效果[14]。此外，研究认为，细胞凋亡时，丙二醛（MDA）由细胞膜脂质双层的内侧外翻，是衡量细胞应激严重程度，细胞受到严重损伤的重要指标之一[15]。本实验的ELISA 实验发现：与对照组相比，AgNP 组MDA 表达水平下降，表明AgNP 在抗自由基损伤中起着重要作用。Akt 抑制剂组Total-SOD 含量降低，MDA 表达升高的结果，提示AgNP 能够通过激活Akt 信号通路上调Total-SOD 表达。也有研究揭示AgNP 通过Akt-AMPK-mTOR 途径诱导HC11 细胞产生保护性自噬氧化应激和线粒体膜电位改变，与细胞氧化应激和线粒体改变有关[16]。当然，我们并不否定AgNP 除了Akt 途径外，AgNP 也可能激活Erk[17]、MAPK[18]等信号通路发挥作用，关于AgNP 对细胞的分子机制还需要在今后的细胞水平和动物水平进行深入研究。

综上所述，纳米银通过Akt 通路促进表达Total-SOD，提高BMSCs 增殖，抑制其凋亡。在后续实验中，我们将利用炎症、缺氧等细胞模型，深入揭示纳米银对间充质干细胞增殖、分化等影响和分子机制，以便为纳米银的基础研究和临床应用奠定研究基础。