基于网络药理学探讨鹤蟾片治疗非小细胞肺癌的作用机制研究

陈志辉， 周锐， 唐莹， 周岱翰

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510405；3.广州中医药大学肿瘤研究所，广东 广州 510405

在全世界范围内，恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，因其具有高发病率、高复发率、高死亡率等特点而备受关注。据统计，2018年全球新增癌症患者1 810万，我国占380.4万例，其中肺癌的发病率为11.8%，病死率为18.4%[1]。而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC）约占了所有类型肺癌的80%，且五年生存率低于10%[2]。目前NSCLC的治疗主要有手术、放疗、化疗、分子靶向治疗、免疫治疗和中医药治疗等。其中，中医药在治疗NSCLC方面具有独特优势，除了可延长患者生存期，还可减少放化疗和分子靶向治疗的毒副反应[3-4]。

鹤蟾片是国医大师周岱翰教授的经验方，有多年的临床应用基础。鹤蟾片主要由仙鹤草、干蟾皮、半夏、天冬、浙贝母、猫爪草、葶苈子、鱼腥草、人参组成，方中干蟾皮清热解毒，利水消胀；仙鹤草补虚止血；半夏、猫爪草、浙贝母化痰散结；鱼腥草清热解毒，消痈排脓；葶苈子泻肺平喘，利水消肿；天冬养阴润燥，清肺生津；人参大补元气，补脾益肺，全方配伍，具有解毒除痰、凉血养阴、消癥散结等功效，用于治疗原发性支气管肺癌及肺部转移[5]。目前已有多项研究表明，鹤蟾片具有抑瘤作用。周岱翰等[5]用鹤蟾片治疗102例晚期肺癌患者(单服鹤蟾片组62例，手术治疗配合鹤蟾片组31例，化疗配合鹤蟾片组9例）。其中单服鹤蟾片组，显效6例，有效33例，总体有效率为62.9%，平均生存时间7.66个月；手术治疗配合鹤蟾片组有效26例，平均生存时间9.1个月；化疗配合鹤蟾片组显效1例，有效4例，平均生存时间6.1个月。鹤蟾片对于肺癌的治疗具有较好的临床疗效，而此次的研究也获得了全国中医药重大科技成果乙等奖。熊绍权等[6]研究发现，鹤蟾片含药血清对人肺腺癌A549细胞具有生长抑制作用，并证实为通过诱导细胞凋亡途径，其分子机制可能与抑制EGFR基因的转录表达有关。本研究通过网络药理学方法，构建“鹤蟾片-活性成分-靶点-非小细胞肺癌”网络，结合生物学信息分析，探索更多有关鹤蟾片治疗NSCLC的潜在靶点及作用机制。

1 材料与方法

1.1 鹤蟾片化学成分收集与筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）寻找鹤蟾片(仙鹤草、干蟾皮、半夏、天冬、浙贝母、猫爪草、葶苈子、鱼腥草、人参）9味中药化学组成成分，根据口服利用度(oral bioavailability，OB）≥30%且类药性(drug likeness，DL）≥ 0.18的2个体外药代幼力学属性值进行活性成分的初步筛选，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性成分。

1.2 中药活性成分靶点预测与共同靶点筛选

通过PubChem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取中药活性成分的结构，将其2D结构保存为SDF格式。将活性成分结构导入Swiss Target Prediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch）中进行靶点预测，以获取活性成分的靶点。其中把Probability＜0.1的靶点及未能预测到的活性成分进行剔除。

通过GeneCards数据库(https：//www.genecards.org）检索“非小细胞肺癌”靶点，以Score值为条件获取疾病靶点。将中药活性成分预测靶点与非小细胞肺癌疾病靶点取交集，获得成分-疾病共同靶点。之后使用Cytoscape 3.8.2构建“鹤蟾片-活性成分-靶点-非小细胞肺癌”网络，筛选出主要活性成分。

1.3 PPI网络构建及核心靶点筛选

将交集靶点提交至STRING11.0数据库(https://string-db.org）构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI）网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(＞0.9），其余设置均为默认设置，得到PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape 3.8.2进行可视化，并使用Network Analyzer功能计算Degree值，根据Degree值筛选核心靶点。

1.4 GO功能富集与KEGG通路富集

使用R软件3.6.2中的“clusterProfiler”包对核心靶点进行富集分析，包括基因本体论(gene ontology，GO）和生物学通路(biological pathway）富集分析，使用Bonferroni检验法校正P值，并设定P＜0.05，筛选出具统计学意义的生物学过程和信号通路。

2 结果

2.1 鹤蟾片活性成分的筛选及靶点的获取

通过TCMSP数据库以及已发表的相关文献报道检索鹤蟾片的活性成分，其中仙鹤草41个，干蟾皮30个，半夏116个，天冬32个，浙贝母17个，猫爪草79个，葶苈子68个，鱼腥草50个，人参190个。根据ADME筛选后获得活性成分共99个，其中仙鹤草5个，干蟾皮12个，半夏13个，天冬9个，浙贝母7个，猫爪草12个，葶苈子12个，鱼腥草7个，人参22个。将99个中药活性成分导入PubChem数据库，剔除无法获得结构或结构种类不明确的活性成分，最终得到活性成分72个，其中仙鹤草4个，干蟾皮8个，半夏12个，天冬6个，浙贝母6个，猫爪草8个，葶苈子9个，鱼腥草5个，人参14个(见表1）。将72个活性成分导入SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测，共得到预测靶点3 233个，去除重复靶点后，得到活性成分靶点772个。

表1 鹤蟾片的活性成分Table 1 Active components of He Chan Tablets

2.2 非小细胞肺癌疾病相关靶点的获取

在GeneCards数据库中检索到非小细胞肺癌相关靶点共计19 240个，根据经验，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为非小细胞肺癌的潜在靶点。因此选取Score≥37.16的1 204个靶点作为非小细胞肺癌的潜在靶点。

2.3 鹤蟾片活性成分-非小细胞肺癌共同靶点的获取

将筛选的772个鹤蟾片活性成分靶点与非小细胞肺癌的1 204个靶点取交集，得到交集靶点228个(见图1）。将72个鹤蟾片活性成分与228个潜在靶点，通过Cytoscape 3.8.2软件构建“鹤蟾片-活性成分-靶点-非小细胞肺癌”网络(见图2），经过NetworkAnalyzer网络拓扑分析后，得出度值(Degree）最高的5个活性成分(见表2），这5个成分可能是鹤蟾片治疗NSCLC的主要活性成分。

图1 鹤蟾片活性成分靶点与非小细胞肺癌靶点韦恩图Figure 1 Venn Diagram of relationship between active components targets of HeChan Tablets and NSCLC potential targets

图2 鹤蟾片活性成分-非小细胞肺癌靶点网络Figure 2 The “compound-target-disease” network of HeChan tablets and NSCLC.（The blue nodes represent the active components of HeChan tablets；The green nodes represent potential targets；The red nodes represent HeChan tablets；The size of the nodes represent the degree）

表2 鹤蟾片度值排名前5的主要活性成分Table 2 The main five active components of He Chan Tablets

2.4 核心靶点的筛选及可视化

将228个共同靶点导入String 11.0数据库检索其相互作用的蛋白，得到216个节点(其中SCN9A、 PLA2G2A、 P2RX7、 HNF4A、 GBA、TYR、HPGD、ANPEP、ROS1、MIF、CHRNA3、NQO2无相互作用，故剔除），1574条边，置信度≥0.90的PPI网络。采用Cytoscape 3.8.2进行筛选核心靶点及可视化，使用Network Analyzer进行拓扑分析后，以degree≥9为筛选条件，最终获得116个核心靶点和1 513条边(见图3）。度值排名前10的核心靶点见表3。

表3 度值排名前10的核心靶点Table 3 The main potential targets of HeChan Tablets

图3 鹤蟾片-非小细胞肺癌核心靶点的蛋白互作网络Figure 3 The PPI network of the main potential targets between HeChan tablets and NSCLC.（The size of the nodes represent the degree；The colour represent the betweenness centrality）

2.5 核心靶点的富集分析

使用R软件中的clusterProfiler包对核心靶点进行富集分析。GO分析包括分子功能(Molecular Function， MF）、 生 物 过 程(Biological Process，BP）、和细胞组成(Cellular Component，CC）三个部分，结果见图5。MF富集结果显示：核心靶点主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、激素受体结合等功能；BP富集结果显示：核心靶点主要涉及肽基酪氨酸磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化、蛋白激酶B信号、磷脂酰肌醇介导的信号传导、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导等生物过程；CC富集结果显示：核心靶点主要涉及细胞膜、神经元胞体、黏着斑、蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等细胞成分。根据核心靶点通路的富集分析结果，主要涉及的通路有：PI3K-AKT信号通路、癌症中的蛋白多糖、非小细胞肺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、前列腺癌、胰腺癌等通路(见图4）。

图4 核心靶点的富集分析结果（注：A：GO-MF分析；B：GO-BP分析；C：GO-CC分析；D：KEGG分析）Figure 4 Result of the GO enrichment analysis（A：GO-Molecular Function；B：GO-Biological Process；C：GO-Cellular Component；D：KEGG pathway）

3 讨论

古代并无肺癌病名，文献中关于“咳嗽”“肺痿”“痰饮”“肺积”“息贲”等病证的描述与肺癌具有高度相似性。周岱翰教授在多年的临床实践过程中，认为肺癌的辨证不离“痰”“瘀”“虚”“毒”四个方面。病机特点总属“本虚标实”，本虚以肺脾两虚多见，久病入络，病久及肾，标实则痰瘀互结常见。根据肺癌的发病特点将肺癌分为肺郁痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚4种证型。鹤蟾片全方配伍，具有解毒除痰、凉血养阴、消癥散结的功效，切中肺癌“痰”“瘀”“虚”“毒”的辨证特点。

网络药理学是基于网络观点从系统水平识别“疾病-表型-基因-药物”的多层次关系，体现了中药多成分-多靶点-多途径作用的特征，符合中医药整体观及组方配伍原则，是中药研究和新药发掘的一种新方法[7]。本研究通过网络药理学方法，构建“鹤蟾片-活性成分-靶点-非小细胞肺癌”网络，得出鹤蟾片的5个主要活性成分为：黄芩素(baicalein）、槲皮素(quercetin）、异鼠李素(isorhamnetin）、山柰酚(kaempferol）、五味子酯乙(Gomisin B）。黄芩素属于黄酮类化合物，研究表明黄芩素具有多种药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、抗血栓形成、抗肿瘤和保护肝脏、心脑血管、神经元等作用[8-13]。而黄芩素在非小细胞肺癌方面，主要是通过细胞周期进程、凋亡相关蛋白及通路、血管生成、上皮－间充质转化、肿瘤微环境、抗氧化等多方面调控NSCLC细胞的增殖、凋亡、侵袭、化疗敏感性等生物学行为，具有广泛的抗肿瘤作用[14]。鹤蟾片中的仙鹤草、鱼腥草、葶苈子、天冬都含有槲皮素，研究表明槲皮素具有明显的抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与STAT3信号通路的抑制有关[15]。罗进勇等[16]发现槲皮素能抑制肺腺癌A549细胞的生长，其机制可能与上调促凋亡蛋白p53表达和下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达有关。朱玲等[17]进行体内外研究结果表明异鼠李素可下调bcl-2基因、PCNA蛋白表达，上调抑癌基因P53，bax及caspase-3基因，抑制人体肺腺癌A549细胞生长。张敬等[18]发现山柰酚可通过抑制雌激素受体相关受体发挥降低非小细胞肺癌A549细胞侵袭和迁移能力。刘小东等[19]发现五味子酯乙能高效逆转肺癌耐紫杉醇A549/Tax细胞对多种化疗药物的耐药性，其机制可能与抑制P糖蛋白的药物外排功能和下调其蛋白表达有关。

根据PPI网络结果显示，本研究的核心靶点为PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、AKT1、SRC 等。而根据KEGG富集分析结果显示，PI3K-AKT信号通路为主要通路，其次为癌症中的蛋白多糖、前列腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、胰腺癌、非小细胞肺癌等通路。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是一种可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂类激酶，在PI3K家族中，研究最广泛的是能被细胞表面受体所激活的Ⅰ型PI3K。IA型PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85所组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性[20]。PIK3R1基因编码表达PI3K的调节亚单位p85，而PIK3CA基因编码表达PI3K的催化亚单位p110。研究表明[21]PI3K在非小细胞肺癌发展中起重要作用，当PIK3CA基因突变可导致p110α酶活性增强、激活AKT信号、减少细胞对生长因子的依赖、抑制细胞的凋亡和促进肿瘤的侵袭。Akt基因是一个丝/苏氨酸蛋白激酶，又被称为蛋白激酶B，是PI3K下游的作用靶点[20]。研究表明[22]AKT是PI3K/AKT信号通路的核心，激活状态的AKT表达升高被证实存在于43%～90%的NSCLC病例中，而且激活状态的AKT表达于早期的原发性肿瘤中的患者往往预后差，且AKT的过度激活与肿瘤的发生、发展及侵袭、转移等有关。PI3K/AKT通路是NSCLC最常见的调控途径之一，其对癌细胞的生存以及疾病的发生发展都至关重要，包括肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞凋亡促进血管生成和化疗耐药等都与PI3K/AKT通路相关[23]。因此阻断PI3K/AKT信号通路有可能抑制NSCLC的生存途径并诱导其凋亡。此外，研究表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK）的过度激活与肿瘤的发生、发展及侵袭和转移过程密切相关[24]。张洁等[25]发现Src作为胞浆内蛋白，能与细胞膜上的许多生长因子受体相互作用，进而激活Src蛋白。激活的Src蛋白使其下游信号发生瀑布效应，通过组织MAPK以及STAT3信号通路促进肿瘤细胞增殖和转移[26]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法初步探讨了鹤蟾片治疗非小细胞肺癌的主要活性成分、核心靶点、信号通路，揭示鹤蟾片是通过多成分、多靶点、多通路共同发挥药理作用。但限于网络药理学方法的局限性，本研究结果可能出现药物活性成分及潜在靶点收集不全、或数据库信息未能及时更新所致研究结果不准确等问题，后续仍需通过动物和细胞实验加以佐证。