原因不明复发性流产与先兆流产患者外周血单核细胞上Tim-3、PD-1与Th1/Th2细胞因子的关系

张 有 闫正平 张华旭 朱君涵

解放军第九四三医院(武威，733000)

自然流产占全部妊娠的15%，多见于妊娠12周前。先兆流产(TA)如未及时有效控制可发展为难免流产[1]。流产次数较多者往往复发率越高，复发性流产(RSA)病因较复杂，40%～50%病因不明确者为流产原因不明复发性流产(URSA)[2]。近年来，越来越多的研究发现CD4+辅助T淋巴细胞1型与2型亚群(Th1/Th2)细胞漂移在URSA的发生发展过程中有重要作用，如出现以Th1为主介导的细胞免疫攻击，则可引起母胎耐受失衡而导致流产[3]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)是Th1表面标志物，在免疫反应与炎症控制中具有负调节作用[4]。程序性死亡因子-1(PD-1)是一种CD28超家族成员，对T细胞增殖及相关细胞因子的生成具有抑制作用，并可抑制B细胞的增殖、分化与免疫球蛋白转换过程[5]。本研究分析了URSA、TA孕妇外周血单核细胞上Tim-3、PD-1、Th1/Th2细胞因子水平变化，并分析了其相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2017年1月-2018年1月本院妇科门诊就诊的URSA患者40例为URSA组。纳入标准：①同一性伴侣自然流产≥2次且无死胎及死产史；②夫妻双方染色体正常，胚胎染色体正常，无家族遗传病史；③配偶精液检查正常；④无内分泌激素异常、自然免疫性疾病、生殖道解剖异常；⑤无支原体、衣原体、疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫等全身及生殖道感染；⑥封闭性抗体、抗核抗体、抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗精子抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)及抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)均呈阴性；⑦妇科检查及超声检查等证实为宫内妊娠；⑧年龄18～40岁。排除标准：①合并子宫肌瘤、子宫腺肌症及宫颈粘连等妇科疾病者；②近3个月内接受免疫类制剂及甾体类药物，近1个月内使用抗生素；③存在妊娠合并症或并发症；④合并严重心、脑、肝、肾等重要脏器疾病或功能障碍。选择同期妇科门诊就诊的TA患者40例为TA组。纳入标准：①符合TA诊断标准[1]；②单胎妊娠；③无化学物质、放射线接触史；④无遗传性疾病及其他严重疾病史；⑤年龄18～40岁。排除标准：①存在妊娠合并症或并发症者；②生殖道发育畸形、生殖系统感染及习惯性流产者；③具有自身免疫性疾病、传染性疾病及自身免疫性疾病病史者；④合并严重心、脑、肝、肾等重要脏器疾病或功能障碍。同期产科门诊健康妊娠早期孕妇40例(健康早孕组)，年龄18～40岁，均为单胎妊娠，B超提示胚胎发育正常。均无家族遗传史及染色体异常，无阴道出血及腹痛等症状，既往无自然流产史及不良生产史(死胎、死产等)，无生殖道感染、内分泌紊乱、遗传性疾病、传染性疾病及自身免疫性疾病病史。受试者均自愿知情且签署知情同意书，能够配合临床研究。研究获得医院伦理委员会审核且批准。

1.2 主要仪器与试剂

美国Beckman Coulter公司产CyAN-ADP型流式细胞分析仪，台式告诉冷冻离心机；美国Thermo公司产气套式三气培养箱与全波长扫描式多功能酶标仪；日本TOMY公司产全自动高压灭菌器。主要试剂：经荧光素标记物异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、与别藻青蛋白(APC)标记过的鼠抗人CD14-FITC、Tim-3-PE与PD-1-APC，同型对照鼠IgG1-FITC/PE由美国Biolegend公司提供。人白介素-2(IL-2)、IL-12、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-6、IL-10酶联免疫吸附(ELISA)法试剂盒来自美国美国R&D公司进口分装。

1.3 样本制备与检测

1.3.1样本采集采集各组妇女晨空腹静脉血离心分离获得外周血单个核细胞(PBMCs)，采用细胞计数板计数，制备细胞悬液(1×106～2×106/ml)。于4h内收集血浆置-20℃保存待测。

1.3.2 Tim-3、PD-1 取PBMCs悬液100μl分别加入CD14-FITC、PD-1-PE和Tim-3-PE各5μl，每管均设置同型对照。轻微混匀后室温下避光孵育15min，再加入2ml的Buffer工作液洗涤，离心弃上清液，再次加入Buffer工作液500μl重悬细胞，上机检测分析CD14+单核细胞上的Tim-3、PD-1表达水平，计算占CD14+细胞的百分比。

1.3.3 Th1/Th2细胞因子取出-20℃冻存的血浆标本置室温下解冻，离心，采用ELISA法测定Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料比较

3组年龄、孕前体质指数(BMI)、孕周、孕囊直径及血清孕酮(P)水平无差异(P>0.05)。见表1。

表1 3组一般资料比较

2.2 单核细胞上Tim-3和PD-1表达

Tim-3和PD-1表达URSA组最低，TA组居中，健康早孕组最高(P<0.05)。见表2。

表2 3组单核细胞上Tim-3和PD-1表达水平比较

2.3血浆Th1/Th2细胞因子表达

3组的IL-2、IL-12、IFN-γ水平URSA组最高，TA组居中，健康早孕组最低；3组的IL-4、IL-6、IL-10水平健康早孕组最高，TA组居中，URSA组最低(均P<0.05)。见表3。

表3 3组血浆Th1/Th2细胞因子表达水平比较

2.4 Tim-3、PD-1与Th1/Th2细胞因子表达相关性

相关性分析显示，URSA组、TA组的外周血单核细胞上Tim-3和PD-1表达均呈正相关性(r=0.649、0.451，P<0.05)；Tim-3表达与IL-2、IL-12、IFN-γ呈负相关性，与IL-4、IL-6、IL-10呈正相关性(P<0.05)；PD-1表达与IL-2、IL-12、IFN-γ呈负相关性，与IL-4、IL-6、IL-10呈正相关性(P<0.05)。在URSA组中各相关性高于TA组。见表4。

表4 Tim-3、PD-1表达与Th1/Th2细胞因子表达的相关性

3 讨论

现代免疫学认为，母体与胎儿共存主要受子宫局部免疫调节的影响，由免疫介导的排斥与耐受、促炎与抗炎平衡在母-胎界面中具有重要作用，若妊娠期间母-胎免疫排斥、胚胎或胎儿的免疫耐受降低则可导致流产，以URSA及TA较为常见[6]。近年来，随着母-胎免疫平衡概念的强化与发展，Th1/Th2免疫平衡在胚胎种植及妊娠维持中的作用受到越来越多学者的关注。成功的妊娠是以Th2型细胞因子为主参与的免疫应答，临床称为“Th2现象”，而当平衡偏移Th1细胞时可损伤胎盘甚至诱发流产[7]。因此，研究URSA与TA的Th1/Th2细胞因子失衡情况及相关免疫调节因子变化，对URSA与TA的临床防治具有重要意义。

Th1型细胞因子主要介导局部炎症相关性免疫应答与细胞毒性反应，可辅助抗体的生成，从而参与机体细胞免疫反应及迟发型超敏反应过程。IL-2是由Th1细胞分泌的炎性细胞因子，能够增强T细胞的杀伤活性，诱导B细胞增殖以及免疫球蛋白的生成，激活巨噬细胞并增强其吞噬作用，还可诱导T细胞分泌出TNF-α、IFN-γ等，并与之协同作用诱导自然杀伤细胞(NK)的增殖分化及NK样细胞转化成为杀伤细胞，在淋巴细胞激活作用下可导致胎盘组织损害[8]。IL-12参与机体固有免疫与适应性免疫的调节。临床研究发现，IL-12能够诱导T细胞向Th1细胞分化，而降低IL-12水平能够抑制妊娠期母体Th1细胞活性，削弱母-胎免疫排斥反应维持妊娠[9]。IFN-γ能够增强NK细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞的活性，刺激母体免疫应答反应引起胚胎排斥反应[10]。还有研究发现，IFN-γ能够促进绒毛膜外滋养层细胞的凋亡，还可下调基质金属蛋白酶-2(MMP-2)水平，从而抑制人绒毛膜外滋养层细胞的生长、浸润而阻碍胚胎着床[11]。Th2型细胞因子中以IL-4最为典型，参与了机体的体液免疫应答过程，能够影响NK细胞的应答反应，且抑制淋巴因子对杀伤性细胞的激活作用，进而抑制IL-2生成及受体表达，诱导Th1细胞向Th2细胞转化[12]。Th2细胞因子IL-6也被证实在女性生殖过程中发挥着重要的调节作用，其可刺激B细胞而影响母体免疫机制，限制或降低母-胎免疫排斥反应，确保妊娠维持[13]。IL-10也是由Th2细胞分泌的重要抗炎因子，其可抑制Th1细胞因子的生成，抑制其活性，可抑制IFN-γ的生成及其对NK细胞活化的促进作用，还可促进活化B细胞的增殖及抗体生成，在妊娠维持中具有重要意义[14]。袁静等[15]研究显示，RSA患者存在明显的母胎界面免疫调节异常所致免疫耐受失衡，表现为Th1/Th2平衡向Th1型细胞漂移。赵英等研究显示，RSA患者外周血Th1/Th2细胞因子存在明显异常表达，表现为IL-2、IFN-γ高表达和IL-4、IL-10低表达，且与蜕膜组织中细胞凋亡有关。说明Th1/Th2平衡在妊娠维持中具有重要意义，Th1型细胞因子占优势时可能导致流产。本研究中，URSA组的Th1细胞因子高于健康早孕组，Th2细胞因子低于健康早孕组，且异常变化较TA组更为明显。进一步证实Th1/Th2细胞因子失衡与URSA、TA的发生发展有关，且URSA可能具有更强烈的免疫失衡，但其水平变化是否与某些免疫因子的调控作用有关尚不得而知。

Tim-3和PD-1均为近年来新发现的T细胞负性调节分子，对T细胞反应具有负性调节作用，被认为是T细胞耗竭的标识[17]。Tim-3能够结合其配体半乳糖凝集素-9(Gal-9)而抑制T效应细胞Th1、Th17细胞的分化或可诱导其凋亡，而Gal-9可促进裸T细胞分化为Treg并可抑制Treg向Th17细胞转化，从而增强免疫耐受[4]。PD-1则多表达于慢性疾病的T细胞中，能够抑制Th1细胞增殖及其相关促炎细胞因子的分泌，协同刺激Th1型细胞向Th2型细胞转化，起到负性调节免疫应答的作用[5]。Xu等[18]研究发现，Tim-3和PD-1能够调节CD8+T细胞而调节母胎平衡，从而维持正常妊娠。本研究中，URSA组与TA组CD14+单核细胞上Tim-3和PD-1表达占比低于正常早孕组，且URSA组更低，且URSA组与TA组中，Tim-3与PD-1表达均呈正相关性。初步提示Tim-3与PD-1在母胎免疫中具有负调控作用，两者可能协同作用，在维持正常母-胎免疫耐受过程中具有重要作用。但国内外针对PD-1与母胎免疫耐受的研究多集中于动物研究或体外研究，缺乏对URSA及TA患者的研究，对两者是否可调控Th1/Th2平衡尚不完全明确。

本研究相关性分析显示，URSA组和TA组的Tim-3与PD-1表达水平与Th1细胞因子水平呈负相关性，而与Th2细胞因子水平呈正相关性，与何泽现[19]、朱一喜等[20]报道基本相符。李春等[21]研究显示，PD-1/PD-L1与女性Th1/Th2细胞因子密切相关，且受激素水平的影响。Shimona等[22]认为，Tim-3是调节妊娠免疫耐受的重要因子，在维持妊娠中具有重要意义。卿吉琳等[23]发现，Tmi-3及其配体Gal-9在URSA外周血及蜕膜中均呈异常表现，且与Th1/Th2、Th17/Theg等细胞因子相关；但贾秋桦等[24]发现，URSA患者的绒毛及蜕膜组织中Tim-3表达增强，但并未检测外周血单核细胞上的表达情况，这与本研究结果略有不同，认为URSA患者的外周血单核细胞Tim-3表达特征可能不同于其在绒毛及蜕膜上的表达，推测其可能参与了URSA发生及发展的不同阶段，从而维持母-胎免疫排斥与耐受之间的平衡。URSA与TA患者存在单核细胞上Tim-3和PD-1低表达，可导致Th1细胞向Th2转化减少，引起Th1/Th2失衡，使孕妇体内Th2主导的免疫保护性应答转为以Th1为主的免疫损伤，引起母胎免疫排斥从而诱发流产。

综上所述，URSA与TA患者的外周血单核细胞上Tim-3及PD-1表达水平降低，二者可能通过上调Th1型细胞因子和下调Th2细胞因子而间接影响母体免疫，诱发URSA和TA。免疫治疗可能是未来URSA与TA防治的研究方向。但本研究样本较小，且缺乏启动免疫干预后各项指标的随访观察，Tim-3、PD-1表达对Th1/Th2平衡的影响作用机制尚不完全明确，还有待进一步研究。