天蚕素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表达及其分离纯化工艺研究

何成霞，邹强，刘达玉，苟兴华，陶雪菊，詹茂，黄海韬

(成都大学 食品与生物工程学院，成都 610106)

真菌、细菌等的污染已成为危害食品安全的一个重要问题，研究表明来源于动植物中的活性成分能够抑制食品中病菌的生长繁殖[1]，其中最早发现于惜古比天蚕中的天蚕素抗菌肽(Cecropin)[2]是研究热点之一，Cecropin在宿主防御系统中起着非常重要的作用[3]，其结构特殊能快速渗透细胞膜，破坏、裂解细菌从而达到抗菌目的[4-5]。研究显示，Cecropin具有较强的抑菌活性，在食品防腐添加剂工业中具有潜在的应用价值，康苏等[6]在番茄汁、葡萄汁中添加Cecropin XJ，结果显示其能有效抑制果汁中致病菌生长，Maya Fitriyanti等[7]利用超声波细胞粉碎技术与Cecropin P1联合使用，对牛奶、橙汁等进行处理，发现超声波联合Cecropin P1使用对牛奶和橙汁中的大肠杆菌具有明显的抑制作用，赵国萍等[8]认为柞蚕抗菌肽在酸性条件下的抗菌活性更强，适用于酸性食品防腐。

天然的食品防腐剂是未来食品防腐工业的发展方向[9]，但是从自然中提取抗菌肽耗时长、效率低，而化学合成成本较高[10]，这些都阻碍着抗菌肽的发展，随着基因工程技术的应用，越来越多的研究者利用该技术生产出具有高活性、高表达量的抗菌肽，因此利用基因工程技术表达Cecropin融合蛋白，是提高其表达水平，降低其生产成本的有效途径。本研究通过对Cecropin A融合蛋白的表达条件、纯化方法进行优化，包括测试种子菌接种浓度、诱导时间、温度及培养基pH等因素对表达的影响以获取最佳表达条件，采用亲和层析方法分离纯化Cecropin A融合蛋白，这些为提高Cecropin A融合蛋白的表达水平及纯化效果、降低其生产成本奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组表达质粒pET-32a-CA:由本实验室构建；大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)BL21:由本实验室保存；LB液体培养基；ZYM-5052液体培养基；Ampicillin:购自上海捷瑞生物工程有限公司。

ZYM-5052液体培养基[11]及缓冲液的配制方法如下：

50×5052培养基：取25 g甘油，加水稀释，加入2.5 g葡萄糖溶解，再加入10 g乳糖溶解后纯化水定容至100 mL 。

50×M试液：取17.75 g磷酸氢二钠(含12个结晶水)用纯化水溶解后，加入17 g磷酸二氢钾溶解，然后加入13.4 g氯化铵溶解，最后加入3.55 g硫酸钠溶解，用纯化水定容至100 mL。

1% ZY培养基：取2 g胰蛋白胨、1.0 g酵母提取物加纯化水溶解并定容至100 mL。

MgSO4试液(0.1 mol/L)：取2.465 g的MgSO4·7H2O加纯化水溶解并定容至100 mL。

1000×微量金属：称取0.222 g CaCl2、0.012 g H3BO3、0.288 g ZnSO4、0.198 g MnCl2、0.0484 g NaMoO4、0.047 g NiCl2、加纯化水混匀并定容至50 mL。

ZYM-5052：量取2 mL 50×M试液、2 mL 50×5052培养基、2 mL MgSO4试液(0.1 mol/L)、20 μL 1000×微量金属、50 mL 1% ZY培养基，用纯化水溶解并定容至100 mL，121 ℃，高压灭菌20 min。

20 mmol/L PB缓冲液，pH 7.2：称取2.58 g Na2HPO4·12H2O、0.44 g NaH2PO4·2H2O加纯化水溶解并定容至500 mL。

1.2 仪器与设备

TGL-16G台式离心机 上海安亭科学仪器厂；ZQTY-70S台式温控摇床 上海知楚仪器有限公司；DYCZ-25D电泳槽 北京六一生物科技有限公司；超声波细胞破碎机；His Trap螯合柱；AKTA蛋白纯化仪。

1.3 方法

1.3.1 基因工程菌种子菌制备

取重组表达质粒pET-32a-CA转化E.coli(DE3)感受态细胞，涂LB平板(含终浓度为0.1 mg/mL的氨苄青霉素)，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落接种至新鲜的LB液体培养基(含终浓度为0.1 mg/mL的氨苄青霉素)中，37 ℃，150 r/min培养过夜，获得Cecropin A种子菌。将种子菌保存于甘油管中，-20 ℃冻存。每次诱导前取甘油菌接种至新鲜的LB液体培养基(含终浓度为0.1 mg/mL的氨苄青霉素)中，37 ℃，150 r/min培养过夜，活化种子菌。

1.3.2 种子菌接种量对表达量的影响

例如，在《小英雄雨来》一课教学中，课外详细描述了抗日战争中我国人民的智慧以及勇敢精神，是培养学生逐渐形成坚定不移、宁死不屈精神的重要途径，通过教材内容深入挖掘对于高效落实爱国主义思想教育具有重要意义[2]。因此，结合教学内容以及小学生的理解能力等特点，小学语文教师在实际展开这一课教学时，可以带领班级学生参观当地博物馆以及纪念馆等，促使学生从多个角度出发深刻感受家乡的优秀传统文化，在传统传统文化以及中华民族精神的过程中，实现对小学生传统文化素养以及综合素质的全面培养。

取活化后的种子菌按照浓度分别为：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%加至pH 6.5的 ZYM-5052(含终浓度为0.1 mg/mL氨苄青霉素溶液)液体培养基中，于37 ℃，150 r/min摇床培养，诱导7 h后停止培养，每个因素做3个平行样，SDS-PAGE凝胶电泳检测对应条件下的融合蛋白表达量，获得最佳种子接种量。

1.3.3 诱导时间对表达量的影响

取活化后的种子菌按照2.0%的浓度加至ZYM-5052(含终浓度为0.1 mg/mL氨苄青霉素溶液)液体培养基中，37 ℃，150 r/min摇床培养，从诱导1 h开始每隔1 h取样，将取出的菌体浓度稀释10倍后，以同批次ZYM-5052液体培养基为空白，于600 nm处测定吸光度，并于诱导12 h后停止培养，SDS-PAGE凝胶电泳检测各时间点的融合蛋白表达量。

1.3.4 诱导温度对融合蛋白表达量的影响

取活化后的种子菌按照2.0%的浓度加至pH 6.5的 ZYM-5052(含终浓度为0.1 mg/mL氨苄青霉素溶液)液体培养基中，于25，28，31，35，37 ℃，150 r/min摇床培养，诱导10 h后停止培养，每个因素做3个平行样，SDS-PAGE凝胶电泳检测各温度条件下的融合蛋白表达量，获得最佳诱导温度。

1.3.5 pH值对表达量的影响

1.3.6 扩大培养

取5 L锥形瓶加入2000 mL ZYM-5052(含终浓度为0.1 mg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，按照最优条件，即培养基pH 6.5，培养温度31 ℃，种子菌浓度2.0%，诱导时间10 h，150 r/min摇床培养，SDS-PAGE凝胶电泳检测其表达量，并称取湿菌体重量。

1.3.7 包涵体处理

将自诱导的菌液分别转移至干净的离心管中，离心收集菌体，按照1∶10 (g/mL)加入PBS Buffer重悬菌体并重复以上步骤，于冰浴中超声破菌，超声功率200 W，破碎20 min，离心收集菌体及上清。取包涵体按照1∶10 (g/mL)加入洗涤液(含2 mol/L尿素溶液，0.5% Triton X-100，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)搅拌洗涤0.5 h，10000 r/min离心20 min后，轻轻弃掉部分上清后继续以10000 r/min离心20 min收集包涵体，再按照1∶10 (g/mL)加入PBS Buffer pH 7.4进行重悬，8000 r/min离心10 min收集包涵体。

按照包涵体与8 mol/L尿素溶液比例为1∶15(g/mL)进行配比，缓慢搅拌4～6 h使包涵体完全溶解后，4 ℃，10000 r/min离心10 min，取上清液与2 mol/L尿素溶液，按照体积比为1∶60，流速为0.5 mL/min，将变性后的蛋白质溶液泵入2 mol/L尿素溶液中，缓慢搅拌过夜，进行蛋白质的复性。利用超滤将复性蛋白中的2 mol/L尿素溶液置换成平衡缓冲溶液(含0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)。

1.3.8 融合蛋白纯化

融合蛋白具有能与特异性配基结合的特点，且亲和层析法可以将目的蛋白从复杂的混合溶液中有效地分离出来，本研究将采用亲和层析(affinity chromatography，AC)方法分离纯化融合蛋白[12]。使用AKTA蛋白纯化仪分离纯化目标蛋白，融合蛋白因含有(His)6-tagged标签，能被Ni2+特异识别并被其吸附在柱体上，停留在柱中，而不含(His)6-tagged标签的杂蛋白样品随着缓冲液流出柱体。层析柱使用2倍柱体积的50 mmol/L硫酸镍溶液进行螯合，再使用去离子水冲洗出残余硫酸镍溶液，用平衡缓冲溶液(含0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L PB Buffer，pH 7.2)平衡柱子，然后上样，上样完成后使用2倍柱体积的平衡缓冲溶液冲洗出未接合的蛋白，待基线平衡后分别使用浓度为20，50，200 mmol/L的咪唑溶液洗脱蛋白，并收集样品，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化率。

2 结果与分析

2.1 种子菌接种量对表达量的影响

由图1和表1可知，当种子菌的接种量小于2.0%时，其表达量随着接种量的增加而增加，当接种量大于2.0%时其表达量下降，可能的原因是接种量低时培养基中的营养物质较为丰富，而当接种量上升其表达量也随之上升时，当接入过多的菌种后，培养基中的营养物质很快被消耗殆尽导致其表达量反而降低。结果表明，种子菌的接种量为2.0%时，融合蛋白的表达量为25.1%，虽然在几个浓度中其表达量最高，但是无法满足工业生产需要，可能是培养时间较短所致，后期的实验中应延长培养时间以提高融合蛋白的表达量。

图1 初始种子菌浓度对融合蛋白表达量的影响Fig.1 Effect of initial seed bacteria concentration on the expression amount of fusion protein注：M为Marker；1～3为1.0%；4～6为1.5%；7～9为2.0%；10～12为2.5%；13为负对照。

表1 不同种子菌浓度融合蛋白的表达量Table 1 The expression amount of fusion protein with different seed bacteria concentration

2.2 诱导时间对表达量的影响

诱导时间的长短会影响融合蛋白最终的产量，从表达开始至营养被耗尽的整个过程中，融合蛋白的表达量及菌体浓度一直在变化。SDS-PAGE凝胶电泳显示目标融合蛋白有很明显的表达，随着诱导时间的延长，融合蛋白的表达量及菌体浓度均随之增加，当培养10 h后融合蛋白表达量达到相对较高的水平，其相对表达量为31.5%，利用SPSS软件统计分析表2中7～12 h的融合蛋白表达量，结果显示10～12 h融合蛋白表达量差异不显著，说明当培养到10 h后其表达量已达到较高水平；而由图3可知，随着培养时间的延长，菌体的OD值随之增加，当培养10 h后其OD值较为稳定，一般来说，菌体的数量会随着诱导时间的延长而增加，当菌体量达到最高点时，其生长进入稳定期，活菌数多，但随着时间继续增长，菌体会进入老化期，且外源蛋白也可能会被蛋白酶水解而降低，但本研究中菌体生长进入稳定期后其表达量及菌体OD值并没有随着时间的延长而降低，可能是因为表达产物为包涵体，而包涵体的稳定性较好，不会被蛋白酶所水解。后续实验从节约时间及成本出发，选用培养时间为10 h进行。

图2 诱导时间对融合蛋白表达量的影响Fig.2 Effect of induction time on the expression amount of fusion protein注：M为Marker；1～12分别为1～12 h；13为负对照。

图3 菌体OD600值Fig.3 The OD600 values of bacteria

表2 诱导7～12 h融合蛋白的表达量Table 2 The expression amount of fusion protein induced for 7～12 h

2.3 诱导温度对融合蛋白表达量的影响

温度在培养的初期主要影响大肠杆菌的生长速率，而到培养中后期影响的是融合蛋白诱导表达的量。由图4和表3可知，在选定的5个培养温度下诱导E.coil均能表达融合蛋白，且温度对蛋白的表达水平影响较大，22 ℃时融合蛋白的表达量仅为8.5%，当培养温度从22 ℃升至37 ℃时融合蛋白的表达量随之上升，至31 ℃时融合蛋白的表达量为30.6%，当温度超过31 ℃时融合蛋白的表达量基本保持不变，37 ℃时融合蛋白的表达量为30.5%， 31 ℃与37 ℃融合蛋白的表达量差异不大。温度过低，大肠杆菌的生长受到抑制，对培养基中营养的转化率低，导致融合蛋白的表达量过低；而温度过高，大肠杆菌生长过快，菌体又容易衰老，并且考虑到温度对设备的影响及节约能源，后期的培养温度选择31 ℃。

图4 诱导温度对融合蛋白表达量的影响Fig.4 Effect of induction temperature on the expression amount of fusion protein注：M为Marker；1～2为25 ℃；3～4为22 ℃；5～6为28 ℃；7～8为31 ℃；9～10为35 ℃；11～12为37 ℃；13为负对照。

表3 不同温度条件下融合蛋白的表达量Table 3 The expression amount of fusion protein under different temperatures

2.4 pH值对融合蛋白表达量的影响

由图5和表4可知，培养基pH为5.5时，融合蛋白的表达量仅占大肠杆菌总蛋白的22.3%；当培养基pH值从5.5升至7.0时，融合蛋白的表达量随之上升，pH值为6.5时其表达量占大肠杆菌总蛋白的30.8%，当pH值从6.5上升至8.0时，其表达量差异不显著，可见培养基的pH值对融合蛋白的表达也具有一定的影响，从操作的便利性方面考虑，选择培养基的pH值为6.5进行后续实验。

图5 pH值对融合蛋白表达量的影响Fig.5 Effect of pH values on the expression amount of fusion protein注：M为Marker；1～2为pH 5.5；3～4为pH 6.0；5～6为pH 6.5；7～8为pH 7.0；9～10为pH 7.5；11～12为pH 8.0；13为负对照。

表4 不同pH条件融合蛋白的表达量Table 4 The expression amount of fusion protein under different pH values

续 表

2.5 扩大培养

按照上述各单因素的最优培养条件，即温度31 ℃，种子菌浓度2.0%，培养基pH 6.5，诱导培养10 h，5000 r/min离心后得到湿菌体约为1.2 g/dL，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测其表达量为30.6%，超声破菌后SDS-PAGE凝胶电泳显示绝大部分表达产物为包涵体，占总大肠杆菌的45.2%，而上清液中可溶表达仅为5.9%。可溶表达的优点是蛋白质纯化可以直接上柱分离，不需要变性、复性，工艺较为简单，其缺点是表达产物的量较少。而包涵体表达有优点也有缺点，优点是包涵体表达能很好地避免蛋白水解酶降解表达产物，并且能避免表达产物杀死宿主细胞，使产量大大提高，但是缺点也很明显，包涵体需要经过变性、复性的过程，加入的变性剂可能会引起融合蛋白的不可逆修饰，形成异构体，且工艺较可溶蛋白来说较为复杂。本研究希望获得较多的融合蛋白，而采用本研究的方法进行融合蛋白的表达，其表达产物较高，能满足本研究的研究目的，故本研究将采用包涵体表达的方法进行天蚕素抗菌肽融合蛋白的表达。

2.6 纯化

由图7可知，目标蛋白能很好地结合到Ni+柱上，只有极少数的目标蛋白随缓冲液流出柱外，通过不同浓度的咪唑溶液特定洗脱后，其中浓度为20 mmol/L的咪唑溶液洗脱掉了一部分目标蛋白及大部分杂蛋白，洗脱的目标蛋白占总蛋白的69.2%，200 mmol/L咪唑溶液洗脱的蛋白溶液中目标蛋白的纯化率能达到87%左右，该方法能较好地分离出目标蛋白且纯化率较高。但是由图6可知，20 mmol/L咪唑溶液洗脱了较大部分蛋白，说明目标蛋白的结合能力较弱，可能是缓冲体系的pH及离子强度等对目标蛋白的特异性结合造成影响；朱一丹等[13]的研究表明，在一定的pH值范围内，pH值越高，蛋白结合能力越强，而离子的存在使得更多的疏水基团得以暴露，增强蛋白质的结合能力；Xu Weiyua等[14]及华伟伟的研究也表明his标记的蛋白特异性结合能力受离子强度和pH等因素的影响，故在后期的研究中应加大该方面的研究，使目标蛋白结合更牢，提高目标蛋白的产量。

图6 扩大培养及超声破菌Fig.6 The expanded culture and ultrasonic destruction of bacteria注：M为 Marker；1～3为扩大培养后菌体表达量；4～6为超声破菌后沉淀；7～9为超声破菌后上清液；10为负对照。

图7 融合蛋白纯化Fig.7 The purification of fusion protein注：M为Marker；1为样品溶液；2为穿流缓冲液；3为20 mmol/L咪唑溶液洗脱蛋白；4为50 mmol/L咪唑溶液洗脱蛋白；5为200 mmol/L咪唑溶液洗脱蛋白。

3 结论

许多研究者使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导表达融合蛋白，然而Dvorak P等[15]的研究表明IPTG会加剧底物的毒性，对大肠杆菌BL21(DE3)宿主造成明显的损害，该研究还证明了乳糖是比IPTG更好的诱导剂。故本研究利用培养基中的乳糖，自诱导表达Cecropin A融合蛋白，通过单因素及扩大培养实验证明该方法具有可行性，具体培养条件为温度31 ℃，种子菌接种量2.0%，培养基pH 6.5，诱导培养10 h，最终的融合蛋白的表达量为30.6%，基本满足工业生产需求；菌体破碎后离心得到包涵体，清洗包涵体，再经过变性、复性、超滤等步骤处理包涵体得到复性后蛋白溶液，最后经过亲和层析分离出目标蛋白，纯化率可达到87%以上。