羊肚菌牛肉酱配方优化及挥发性特征风味成分研究

粟立丹，乔明锋，彭毅秦，贾洪锋，段丽丽*，刘蕾，李太明

(1.四川旅游学院 食品学院，成都 610100；2.四川旅游学院烹饪科学四川省高等学校重点实验室，成都 610100)

羊肚菌(Morchellaesculenta)隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)，是一种极其珍贵的天然药用菌，其味道鲜美、风味独特，具有极高的食用价值和药用价值，深受消费者喜爱[1]。羊肚菌富含蛋白质、多糖、粗纤维、维生素等多种营养成分，人体必需的锌、铁、锰等微量元素的含量也很高[2]。中医认为，羊肚菌性平味甘，具有益肠和胃、化痰理气、醒脑提神的功效。现代医学研究表明，羊肚菌中富含的真菌多糖、硒元素、有机锗等具有降血脂、增强机体免疫力、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长等多种功效[3-4]。牛肉是我国主要的畜产品之一，是高蛋白、低脂肪食物，蛋白质含量高达22%，并含有8种人体必需氨基酸，其氨基酸模式与人体组成接近，生物价值高，优于植物蛋白质[5]。酱类食品起源于中国，历史悠久，且具有种类众多、营养丰富、味道鲜美、食用方便等优点，深受世界各地消费者的青睐[6]。近年来，随着健康饮食意识的不断增强，人们对调味食品的要求也日益增高，不但要求它具有良好的色、香、味，还更注重它的营养价值及保健功能。

目前，羊肚菌产品主要是新鲜、干制及灌装等粗加工产品，精深加工产品存在种类单一、工业化水平低、规格和标准不明确等缺陷。羊肚菌产品经济效益不高，市场上还未出现上市的新型羊肚菌食用产品，羊肚菌产业的下游市场相对狭窄，制约了羊肚菌产业的发展。因此，以羊肚菌和牛肉为主要原料，添加豆瓣酱、白糖及天然调味料等，经过炒酱和熬制等工艺研制出一种即食新型羊肚菌风味牛肉酱，为羊肚菌牛肉酱的加工提供了一定的理论支撑和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干羊肚菌：成都金满堂农业科技有限公司；牛肉、郫县豆瓣、食用油、白糖、辣椒粉、香辛料：食用级且符合国家卫生食用标准，市售；乙醚、浓硫酸、可溶性淀粉等：分析纯，本校实验室提供。

1.2 仪器与设备

电磁炉；TP101食品温度计 佳明仪器仪表有限公司；电子分析天平；恒温水浴锅；冰箱；75 μm CAR/PDMS手动萃取头 美国Supelco公司；SQ680气相色谱-质谱联用仪 美国PerkinElmer公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

羊肚菌牛肉酱的制作工艺流程见图1。

图1 工艺流程Fig.1 The process flow diagram

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 牛肉预处理

选择筋膜少、色泽鲜红、肉质鲜嫩的牛肉，有独特的牛肉风味，去除多余的脂肪和淤血等杂质，冷水浸泡25～30 min，用清水洗净，沥干水分，用绞肉机进行绞肉[7-8]。

1.3.2.2 羊肚菌预处理

挑选出形态和色泽良好的羊肚菌，用清水冲洗2遍，洗去泥沙等杂质，切成边长为3 mm的正方形细状均匀体，用少量清水泡发5～10 min，羊肚菌泡软即可。注意泡发时清水不宜添加过多，以免羊肚菌中水溶性氨基酸流失。

1.3.2.3 配料

按照实验要求，准确称取所需原辅料的用量，备用。

1.3.2.4 腌制

称量牛肉糜100 g，添加食盐3 g、白糖8 g、生姜末6 g、蒜末6 g、白胡椒粉3 g、料酒15 g，搅拌均匀，腌制1 h，备用。

1.3.2.5 炒制

使用电磁炉，将锅烧热，倒入50 g食用油，大火使油温升高到150 ℃，加入6 g大葱，炸至大葱焦黄时捞出，加入姜末、蒜末各6 g，花椒、八角、桂皮各3 g，炸出微香，再加入红辣椒粉，小火加热至产生香辣味，且颜色红亮，冷却后弃去姜、蒜、花椒、八角等料渣，备用，注意炸制温度不能过高，时间不能过长，以免出现焦糊味。油锅洗净后加热，倒入100 g食用油，使油温快速升高到150 ℃以上，加入郫县豆瓣酱，炒香，加入腌制好的牛肉糜，翻炒5 min，再加入羊肚菌丁，翻炒至微沸，转小火继续加热5 min，加入制备好的香辣油、白糖，熬煮10 min。

1.3.2.6 装罐、杀菌

将玻璃罐洗净后，用水浴灭菌30 min，羊肚菌牛肉酱熬制结束后，趁热装入玻璃罐中，肉酱定量250 g，罐内保留5 mm左右的顶隙，以免出现胀罐现象，保持中心温度不低于85 ℃，有利于杀菌。趁热旋紧瓶盖，采用高温水浴进行杀菌(15 min，100 ℃)，杀菌完成后，将灌装好的牛肉酱从杀菌锅中取出，采用分段冷却的方法冷却到40 ℃即可[9]。

1.3.3 对照实验

在原料、配料和加工方法相同的条件下，选取羊肚菌添加量为0%制作空白牛肉酱，作为对照实验，对比分析羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱的挥发性风味成分。

1.3.4 单因素实验

在100 g牛肉的基础上，以不同比例的羊肚菌、辣椒粉、白糖、豆瓣酱为单因素进行实验，加入羊肚菌占牛肉的质量为5%、10%、15%、20%、25%，辣椒粉占牛肉的质量为10%、15%、20%、25%、30%，白糖占牛肉的质量为4%、6%、8%、10%、12%，豆瓣酱占牛肉的质量为10%、15%、20%、25%、30%。以感官评价为评价指标，分析各个因素对牛肉酱感官评价的影响，确定各因素的最佳添加量。

1.3.5 正交实验设计

在单因素实验的基础上，选择对牛肉酱感官评价影响较大的4个因素辣椒粉、白糖、豆瓣酱、羊肚菌进行正交实验，以最佳添加量及前后的两个水平梯度作为自变量，以感官评价为指标，采用L9(34)正交实验分析，确定最优的羊肚菌牛肉酱工艺配方，实验因素水平选取见表1。

表1 羊肚菌牛肉酱配方优化正交表Table 1 Optimization of orthogonal test for Morchella esculenta beef paste

1.4 指标测定

1.4.1 牛肉酱的感官评价标准[10]

根据羊肚菌牛肉酱的色泽、风味、口感、组织状态等感官指标，由10名(5男5女)经过培训的评价员对羊肚菌牛肉酱进行感官评定，综合打分后取平均值，评价标准见表2。

表2 感官评价标准表Table 2 The standard of sensory evaluation

1.4.2 挥发性风味物质检测[11]

萃取条件：将按最佳工艺制得的产品搅碎，均匀后准确称取2.00 g置于15 mL的静态顶空萃取瓶中，加入搅拌子旋紧瓶盖，在100 ℃下搅拌20 min，然后将老化至无杂峰的萃取头插入样品瓶，恒温条件下富集60 min，之后取出萃取头并插入GC-MS进样口，解吸10 min。

GC条件：Elite-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)极性色谱柱；载气为高纯氦气(99.999%)，流速1 mL/min ，分流比5∶1，保持2 min。进样口温度：250 ℃，升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 升温至60 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升温至140 ℃，保持1 min，最后以20 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min。

MS条件：电子电离源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围35～400 m/z；全扫描模式。

1.5 数据处理

将质谱检测结果与标准质谱库(NIST 2011)对照，选择正反匹配度均大于800的鉴定结果予以确定。其他数据采用Microsoft Excel 2010软件和Origin 8.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果及数据分析

2.1.1 白糖添加量对产品感官品质的影响

由图2可知，白糖添加量对羊肚菌牛肉酱的感官评分值有明显的影响，白糖添加量在4%～12%范围内，随着白糖添加量的增加，产品的感官评分值也随之增加，当白糖添加量为8%时，牛肉酱的甜味适中，具有令人愉悦的回甜味，此时感官评分值最高，随着白糖添加量的继续增加，产品口感过甜，且覆盖了牛肉酱体特有的风味，感官评分值也开始下降。因此，确定8%为白糖的最佳添加量。

图2 白糖添加量对产品感官品质的影响Fig.2 Effect of white sugar additive amount on the sensory quality

2.1.2 辣椒粉添加量对产品感官品质的影响

由图3可知，辣椒粉添加量对羊肚菌牛肉酱的感官评分值有显著影响，辣椒粉添加量在10%～30%范围内，随着辣椒粉添加量的增加，产品的感官评分值逐渐增大，当辣椒粉添加量为25%时，牛肉酱的辣味适中，具有浓郁的香辣味，此时感官评分值达到最大值，随着辣椒粉添加量的继续增加，产品口感偏辣，感官评分值也逐渐下降。因此，确定25%为辣椒粉的最佳添加量。

图3 辣椒粉添加量对产品感官品质的影响Fig.3 Effect of pepper powder additive amount on the sensory quality

2.1.3 羊肚菌添加量对产品感官品质的影响

由图4可知，羊肚菌添加量对羊肚菌牛肉酱的感官评分值影响较大，羊肚菌添加量在5%～25%范围内，随着羊肚菌添加量的增加，产品具有羊肚菌特有的风味，口感醇厚，风味浓郁，但随着羊肚菌添加量不断增加，产品色泽由油亮的红褐色逐渐变为深褐色。当羊肚菌添加量为20%时，牛肉酱在色泽、风味、口感及组织状态都达到较好的状态，此时感官评分也达到最大值。因此，确定20%为羊肚菌的最佳添加量。

图4 羊肚菌添加量对产品感官品质的影响Fig.4 Effect of Morchella esculenta additive amount on the sensory quality

2.1.4 豆瓣酱添加量对产品感官品质的影响

由图5可知，豆瓣添加量对羊肚菌牛肉酱的感官评分值有显著影响，豆瓣酱主要影响牛肉酱体的组织形态和口感，随着豆瓣酱添加量的增加，牛肉酱的组织形态越好，具有豆瓣酱的特殊风味，当豆瓣酱添加量为20%时，牛肉酱的组织状态、风味及口感均较好，此时感官评分也达到最大值。但随着豆瓣酱添加量的继续增加，产品咸味过重，牛肉及羊肚菌的特征风味被掩盖，感官评分值也开始下降。因此，确定20%为豆瓣酱的最佳添加量。

图5 豆瓣酱添加量对产品感官品质的影响Fig.5 Effect of broad bean paste additive amount on the sensory quality

2.2 正交实验结果及数据分析

参照表1，采用L9(34)正交实验对羊肚菌牛肉酱的配方进行优化，正交实验结果见表3。

表3 正交实验结果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3可知，对羊肚菌牛肉酱感官质量的影响顺序为B>A>C>D，即豆瓣酱用量对样品的影响最大，其次是白糖、辣椒粉和羊肚菌。进一步分析可知，最佳组合为A2B3C1D2，即白糖添加量8%、豆瓣酱添加量25%、辣椒粉添加量20%、羊肚菌添加量20%时，所制得的羊肚菌牛肉酱的感官评分值最高，通过最佳组合的进一步验证实验的感官评分值为91.6，且制得的样品口感和风味极佳，因此确定A2B3C1D2为产品获得最佳感官评分的组合。

2.3 挥发性风味物质结果分析

根据1.4.2的方法对空白牛肉酱(羊肚菌添加量为0%)、羊肚菌牛肉酱(羊肚菌添加量为20%)样品进行GC-MS检测，总离子流图见图6，组分鉴定结果见表4。

图6 样品挥发性成分总离子流图Fig.6 Total ion current chromatograms of volatile components of the samples

表4 各样品中挥发性成分GC-MS检测鉴定结果Table 4 The detection results of volatile components of different samples by GC-MS

续 表

由图6和表4可知，羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测到65种、58种挥发性风味成分。羊肚菌牛肉酱的挥发性风味成分中，包括醇类9种、醛类15种、酮类6种、酯类5种、烃类17种、杂环类5种及其他化合物8种，占总挥发性成分的92.39%。而空白牛肉酱的挥发性风味成分中，包括醇类9种、醛类14种、酮类4种、酯类6种、烃类15种、杂环类3种及其他类7种，占总挥发性成分的86.87%。两个样品共有的挥发性风味成分有50种，包括醇类8种、醛类13种、酮类4种、酯类4种、烃类14种、杂环类2种及其他类5种。其中，芳樟醇、4-萜烯醇、苯乙醛、壬醛、胡椒酮、β-蒎烯、α-松油烯、D-柠檬烯、罗勒烯、茴香脑为主要的挥发性风味物质。

由表5可知，羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱中均检测出9种醇类物质，分别占挥发性物质的10.765%和7.577%，且羊肚菌牛肉酱中醇类物质的相对含量略高于空白牛肉酱。乙醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜烯醇等在两个样品中均被检测出且相对含量较高。醇类物质为样品提供了铃兰香、花果香、丁香花香与胡椒香，这些风味物质主要来源于香辛料[12]。醇类物质的阈值较高，对风味的贡献不大，其中苯乙醇(阈值211)、芳樟醇(阈值6)赋予了样品特有的酱香味[13]。

表5 样品中挥发性化合物的种类及相对含量Table 5 The types and relative content of volatile compounds in the samples

羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测出15种和14种醛类物质，分别占挥发性物质的2.936%和2.766%。醛类物质的相对含量虽然较低，但其阈值大多也较低，对样品的风味贡献大，是肉类风味的主要挥发性成分之一[14]。2-甲基丁醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、柠檬醛、2,4-癸二烯醛等在两个样品种均被检测出，含量高于其他醛类。这些醛分别呈现麦芽香气、焦香、花香、甜芳香与脂肪香，其中2-甲基丁醛主要来自于亮氨酸的Strecker降解反应[15]，壬醛则来自于油酸的氧化[16]。2-庚烯醛和2-壬烯醛只存在于羊肚菌牛肉酱中，呈现出蘑菇香，这两种醛赋予了羊肚菌牛肉酱特有的菌类风味，可能是羊肚菌牛肉酱的特征挥发性风味成分。

羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测出6种和4种酮类物质，分别占总挥发性物质的1.752%和0.742%，两个样品中酮类化合物的种类及相对含量均较低。研究表明，酮类物质主要来源于不饱和脂肪酸的氧化降解，有些酮类物质甚至是形成杂环化合物的重要中间体[17]。说明样品在高温炒制过程中，部分酮类物质发生了转化，造成其种类和含量相对较少。酮类物质主要呈现花香、青香和蘑菇香，但其阈值较高，对样品风味的贡献较小[18]。

羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测到5种和6种酯类物质，占总挥发性物质的0.705%和0.649%。两个样品中酯类物质相对含量低，且种类较少，但酯类物质阈值低，对样品的整体风味具有平衡和调节作用，是一类非常重要的呈香物质[19]。两个样品中检测到的酯类多为乙酸酯类，如乙酸庚酯只在羊肚菌牛肉酱中检测到，略带花香气味，而乙酸香茅酯只存在于空白牛肉酱中，呈现玫瑰香，乙酸辛酯、乙酸松油酯在两个样品中均检测到。这些酯类物质能掩盖样品中某些脂肪酸及胺类物质带来的不愉快气味，对样品风味有重要贡献，使样品整体风味更为柔和饱满。

羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱中分别检测出17种和15种烃类物质，占总挥发性物质的68.586%和68.709%。两个样品中种烃类物质的种类和相对含量均较高，主要分为饱和烃和不饱和烃两类。饱和烃的种类含量较小，且阈值普遍较高，对风味的贡献不大，且只在羊肚菌牛肉酱中检测出饱和烃正辛烷，主要来源于脂肪酸烷氧基的裂解反应[20]。不饱和烃在两个样品中的种类和相对含量较高，以萜烯类物质为主，且阈值较低，气味强烈，对样品风味贡献较大[21]。其中3-蒈烯、β-水芹烯、β-蒎烯、α-水芹烯、α-松油烯、D-柠檬烯、罗勒烯、萜品油烯等的相对含量较高，3-蒈烯只在羊肚菌牛肉酱中检测出，具有令人愉快的果香气味。D-柠檬烯在两个样品中的相对含量高达30%以上，不仅具有强烈的柠檬香，还有消炎、杀菌、抗肿瘤等药理活性[22]。不饱和烃主要源自样品中添加的香辛料，使样品呈现出松油味、柠檬果香及香辛料的特殊气味，说明香辛料中的风味物质较大限度地迁移和释放到牛肉酱中，掩盖了牛肉的肉腥味，使羊肚菌牛肉酱不仅具有特殊浓郁的风味，还具有一定的药理活性作用。

由表5可知，羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测出5种和3种杂环类化合物，占总挥发性风味物质的0.795%和0.318%。杂环类化合物的种类和相对含量虽然较低，但对牛肉酱的风味起着重要的协调作用。3-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、2-乙基吡咯只在羊肚菌牛肉酱中检测到，可能来源于羊肚菌中的多糖与牛肉中的氨基酸发生的美拉德反应，是羊肚菌牛肉酱的特征风味物质。呋喃类、吡嗪类和吡咯类是美拉德反应产生的重要挥发性风味成分[23]，赋予羊肚菌牛肉酱坚果香味、甜香味、焦糖和烧烤食物的气味。

羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱分别检测出8种和7种其他类化合物，占总挥发性物质的6.856%和6.114%。其中烯丙硫醇只在羊肚菌牛肉酱中检测到，二烯丙基硫醚和二烯丙基二硫醚在两个样品中均被检出，这两种物质主要来源于洋葱和大蒜类香料，具有葱香气味，可能是蒜类物质的特征风味物质，对样品的香气特征有重要影响[24]。草蒿脑和茴香脑主要来源于八角茴香等香辛料[25]，这两种物质具有强烈而愉快的香气，在羊肚菌牛肉酱的风味物质中具有重要作用。

3 结论

本研究通过单因素实验和正交实验，结合感官评价分析，对羊肚菌牛肉酱的配方进行优化，并采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分析对比了羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱的挥发性风味物质。结果表明：豆瓣酱的添加量是影响羊肚菌牛肉酱感官品质的关键因素，各因素对产品感官评分的影响顺序为：豆瓣酱(B)>白糖(A)>辣椒粉(C)>羊肚菌(D)，羊肚菌牛肉酱的最佳配方为：白糖添加量8%、豆瓣酱添加量25%、辣椒粉添加量20%、羊肚菌添加量20%，制得的产品感官评分最高。通过GC-MS分析鉴定，从羊肚菌牛肉酱和空白牛肉酱中分别检测到65种和58种挥发性风味成分，占总挥发性成分的92.39%和86.87%。羊肚菌牛肉酱的挥发性风味成分种类和相对含量均高于空白牛肉酱。羊肚菌牛肉酱的挥发性风味物质中包括醇类9种、醛类15种、酮类6种、酯类5种、烃类17种、杂环类5种及其他类8种，其中醇类、醛类、烃类为主要的挥发性风味物质，酮类、酯类、杂环类、其他类对样品的整体风味具有重要的调节和平衡作用。相比空白牛肉酱，羊肚菌牛肉酱共检测出11种特征性风味物质，如：正戊醇、2-庚烯醛、2-壬烯醛、2-戊酮、4-异丙基-2-环己烯-1-酮、正辛烷、3-蒈烯、3-甲基呋喃、2-甲基吡嗪、乙酰基吡咯和烯丙硫醇等，这些物质呈现出醇香、蘑菇青香、花香、坚果香、甜香和烧烤香等特征香味。研究表明，羊肚菌牛肉酱具有独特的食用价值和风味特征，为羊肚菌牛肉酱产品的后续研究及工业生产提供了配方优化和风味特征等理论基础。