热聚合卵白蛋白自组装纤维及其稳定乳液的研究

殷静霖，熊舟翼，熊汉国*

(1.华中农业大学 食品科学与技术学院，武汉 430070；2.武汉农业科学技术研究院农产品加工中心，武汉 430200)

卵白蛋白(OVA)是典型的球蛋白，也是蛋清中唯一含有埋藏于疏水核心内部的自由巯基的蛋白质，相对分子质量为44.5 kDa，由385个氨基酸残基组成，其中50%以上为疏水性氨基酸[1]。在食品中，卵白蛋白常作为乳化剂在油-水界面的分子间和分子内相互作用。但是与小分子量的表面活性剂相比，蛋白在界面的扩散速度较慢，降低界面张力的能力有限，因而乳化能力和界面性能有待进一步提高。

在特定条件下，蛋白均可形成纤维状聚集体，其具有典型的交叉β-折叠结构(cross β-sheet)[2]。研究者针对这一普遍现象进行形成机制研究，以期通过调控蛋白聚集进程来开发其优异的功能性质。近年来，蛋白纤维以其刚性的β-sheet结构和良好的流变学特性引起了生物医药和材料等领域研究者的广泛关注[3]。故食源性蛋白纤维有望成为新一代的功能性材料应用于食品工业。

作为现代食品工业中潜在的养分输送系统之一，乳液在过去几年中受到了相当大的关注。因此，本研究通过高压微射流法构建蛋白纤维稳定的乳液体系，测定不同加热时间的OVA纤维微观结构变化；研究乳液的液滴性质、微观结构和蛋白纤维的界面特性，分析加热时间对乳液微观结构及宏观稳定性的影响机制。通过动态界面张力的变化研究蛋白纤维的界面特性；结合激光共聚焦显微镜(CLSM)与动态光散射技术，分析蛋白纤维乳状液粒径与粒径分布的变化，揭示多相体系中热聚合卵白蛋白自组装纤维的相互作用对乳液稳定性的影响机制，有助于证明蛋白纤维在食品、化妆品甚至石油领域中应用的巨大潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵白蛋白(纯度大于90%)：购于德国Sigma-Aldrich公司；聚乙二醇8000(PEG-8000)：默克化工技术(上海)有限公司；中链甘油三酸酯(MCT)：上海源叶生物科技有限公司；实验中使用的所有其他化学品均由上海国药集团化学试剂有限公司生产，均为分析纯。

1.2 设备与仪器

XHF-DY型均质机 宁波新芝生物技术有限公司；AG-22331型台式离心机 德国艾本德有限公司；Zetasizer Nano-ZS型粒径电位分析仪、Zetasizer 2000型粒径电位分析仪 英国马尔文仪器有限公司；F-4600型荧光光谱仪 日本高新技术公司；JEM-2010型透射电子显微镜 日本电子株式会社；J-1500型圆二光谱仪 日本岛津有限公司；M-110L型高压微射流仪 美国Microfluidics有限公司；HT-HP界面流变仪 法国泰克利斯有限公司；FV3000型激光共聚焦显微镜 日本Olympus公司；HR-3型多功能流变仪 美国TA有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白纤维的制备

将质量分数为2%的卵白蛋白溶解在去离子水中，并通过6 mol/L和1 mol/L的盐酸将溶液pH调节至2.0，在离心力9000 g、4 ℃下冷冻离心30 min。将离心后的上清液通过蛋白质过滤器过滤，除去任何痕量的不溶物。随后将蛋白溶液在85 ℃的水浴锅中分别加热0，6，12，18，24 h，取等分试样，然后立即在冰水中降温并保存在4 ℃的冰箱中，并在7 d内完成所有分析。

1.3.2 乳液的制备

在OVA自组装纤维样品冷却之后，立即与中链甘油三酸酯(MCT)以油体积分数(φ)为0.5的条件下混合，然后使用高剪切混合器在8000 r/min的转速下分散3 min，得粗乳液。随后将粗乳液用高压微射流仪在9000 psi的压力下进行来回处理3次，得到最终的乳液体积为50 mL，然后加入叠氮化钠质量分数(0.04%)以防止微生物生长。乳液在室温(25 ℃)下保存，并于24 h内完成所有分析。

1.3.3 硫黄素T的测定

参考文献[4]的方法并进行如下修改：激发波长为440 nm，发射波长为482 nm，狭缝宽度分别为5，10 nm。

1.3.4 表面疏水性的测定

参考文献[5]的方法并进行如下修改：样品溶液稀释至质量分数分别为0.01%、0.005%、0.0025%、0.00125%，然后在6 mL的稀释液中加入16 μL的8-苯胺基-1-萘磺酸钠(ANS)溶液，混匀后避光静置15 min。

1.3.5 二级结构含量的测定

参考文献[6]的方法并进行如下修改：蛋白纤维样品浓度调整为0.5 mg/mL。

1.3.6 透射电镜(TEM)的观察

参考文献[7]的方法，用去离子水将蛋白样品稀释至浓度为1 mg/mL，然后在透射电子显微镜下观察。

1.3.7 Zeta电位的测定

将制备好的乳液注射进粒子电泳测量皿中，使用Zetasizer Nano-ZS型马尔文电位粒径测定仪分析Zeta电位，测定温度为25 ℃，每个样品重复测定3次以上。通过测量液滴在施加的电场中移动的方向和速度来确定Zeta电位。

1.3.8 界面性质的测定

参考文献[8]的方法，在25 ℃下对所有溶液的动态表面张力进行7200 s的监测。在测试之前，将液相和油相静置至少1 h达到25 ℃。在测试期间，油滴体积为10 μL，所有测量均在0.1%的总蛋白浓度下进行，去离子水用作对照水相。

1.3.9 乳液粒径及粒径分布测定

将制备好的乳液分别散在盛有去离子水的测量皿中，样品被循环蒸馏水自动地稀释到适宜的浓度，得到液滴的测量粒径为体积平均直径(d4,3)和表面平均直径(d3,2)。在粒度计算中使用水的折射率(1.330)、MCT油的折射率(1.440)、吸收参数(0.001)。

1.3.10 乳液微观结构的观察

将2 mL乳液加入10 μL质量分数为0.1%的尼罗红荧光染料中，将混合均匀后的样品在去离子水中稀释100倍，然后将染色的乳液置于显微镜上观察。尼罗红染料的激发波长是573 nm，发射波长是591 nm。

1.3.11 蛋白吸附量及界面蛋白浓度的测定

参照文献[9]的方法，每个样品的界面吸附率(AP，%)和界面蛋白浓度(Γ)的计算如下：

AP/%=(C0-Cf)/C0×100；

Γ/(mg/m2)=(C0-Cf)/6φ×d3,2。

式中：C0是原始卵白蛋白纤维的蛋白质量(mg/mL)，Cf是上清液中的蛋白质量(mg/mL)，φ是油分，d3,2是按1.3.9计算的乳液平均粒径。

1.3.12 乳液流变学性质的测定

参考文献[10]的方法，并进行小幅修改。使用混合流变仪配备的圆形铝平行板(直径60 mm)进行测量：储能模量和损耗正切的变化线性粘弹性范围为0.01～10 Hz，应变为1%。

1.4 数据分析

所有试验数据使用Origin 2019软件作图，并利用SPSS 20.0对数据进行显著性分析及方差分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 热聚合卵白蛋白自组装纤维分析

2.1.1 硫黄素T荧光强度及表面疏水性

硫黄素T是一种阳离子的苯并噻唑染料，能平行插入淀粉样纤维的β-折叠结构并与其结合，导致Th T最大荧光强度显著增大，利用这一原理可以检测蛋白原纤维[11]。

由图1可知，从加热开始，通过Th T荧光测量的OVA纤维的荧光强度迅速增加了近100 a.u.，而且没有明显的延迟或滞后，并在12 h达到200 a.u.，然后在18 h时略有下降，并持续了一段时间，直到加热到24 h。根据Krebs等的研究，淀粉样纤维的形成主要包括3个时期：成核期、增长期和稳定期。由图1可知，本试验的纤维聚集在第一个生长阶段之后，Th T的荧光在第二个阶段继续增加，从而导致前两个阶段急剧增加。同时，随着时间的延长，Th T荧光的降低可能是由于样品的局部凝胶化和/或原纤维结构的破坏，在加热后的样品中可以观察到小的凝胶颗粒，证明了局部凝胶化的可能性。

图1 不同加热时间对硫黄素T荧光强度和表面疏水性的影响Fig.1 Effects of different heating time on the fluorescence intensity and surface hydrophobicity of thiocyanin T

ANS是对环境极性大小反应敏感的一种探针，可以和蛋白疏水部分相互作用，产生荧光发射光谱，因此被广泛应用于表征蛋白疏水基团的暴露情况。蛋白表面疏水性的变化与蛋白分子发生折叠或伸展有关，当蛋白折叠时其表面疏水性降低，当蛋白伸展时，表面疏水性增加。由图1可知，在最初的12 h内，卵白蛋白样品的表面疏水性随着加热时间的增加而增加。加热0 h时表面疏水性为3284.0，而6 h时为3398.9，12 h时为3958.8，这意味着长时间的热处理将大量与结构单元相关的疏水基团暴露在原纤维核中。但是在加热超过12 h时，表面疏水性有所下降，可能是OVA纤维或在凝胶网络结构中暴露的基团的进一步聚集所致。Zhou等也报道过这些展开基团促进了蛋白质凝胶的致密网络形成的结论。表面疏水性的这种趋势证明蛋白质原纤维的形成与蛋白疏水基团有关，并且暴露的疏水基团可能重新缔合以形成更稳定的原纤维结构，这一结果也有助于对蛋白纤维的结构特性做进一步了解。

2.1.2 二级结构含量的测定

远紫外的CD主要由含有发色团的肽段和残基在溶液环境中通过手性相互作用产生，并且通过蛋白肽键排列的方向性差异导致肽键能级跃迁的分裂情况不同，可以由此辨认蛋白质二级结构的有序性。用圆二色谱(CD)对OVA样品进行研究，对不同加热时间的蛋白纤维进行二级结构的分析，结果见图2。

图2 不同加热时间对蛋白纤维的二级结构(A)及二级结构含量(B)的影响Fig.2 Effects of different heating time on secondary structure (A) and the content of secondary structure (B) of protein fibers

由图2可知，在190 nm附近出现一个明显的正峰带，其中特征峰在192 nm处为α-螺旋，在190～200 nm处为β-折叠。加热样品的二级结构与未加热样品的二级结构不同，这证实了热处理能够改变OVA的二级结构并促进蛋白纤维的形成。此外，当加热6 h以上时，OVA原纤维的二级结构变成部分展开的结构。此处的CD结果表明，OVA向着未折叠的形式移动，因此形成了蛋白质聚集体[12]，这也可以解释图1中Th T荧光强度的变化，证明Th T荧光探针与β-折叠相结合且显示出相同趋势。使用CD Pro软件分析所有样品二级结构的相对百分比，结果见图2中B。

比较发现，蛋白质的二级结构在热处理后发生了变化。其中，α-螺旋从6.4%逐渐降低到3.8%，β-折叠从58.9%增加到74.6%。β-转角的比例从13.2%降低到5.8%，无规卷曲的比例从21.4%降低到17.4%。β-折叠的比例明显增加，这可能是加热过程引起的蛋白质结构的拉伸和构象变化所致。同时，卵白蛋白内部疏水基团的暴露增加了蛋白质之间接触的机会，并且分子之间更容易发生聚集[13]。β-折叠结构的形成也是蛋白质原纤维的主要特征之一。二级结构的结果表明，热聚合卵白蛋白自组装纤维的形成需要高温和较长时间的条件，但是过高的温度和加热时间可能会降低β-折叠结构的含量。

2.1.3 透射电镜观察

在不同加热时间的OVA纤维的TEM结果见图3。

图3 不同加热时间对热聚合卵白蛋白自组装纤维形态的影响Fig.3 Effects of different heating time on morphology of self-assembled fibers of thermally polymerized ovalbumin

由图3可知，随着加热时间的延长，聚集体的形态发生了连续变化。未加热的卵白蛋白主要以单个球蛋白或小的聚合物的形式存在(见图3中A)。但是在加热6 h后，大多数单一蛋白已水解成小肽，并且小肽也聚集成纤维形态。当加热12 h后，蛋白纤维结构变得非常明显，纤维形态较厚且相对较长，而且蛋白纤维相互之间紧密连接，显示出非常致密的网络形状，这时可以确定存在半柔性纤维，其长度范围从大约200 nm到几微米。热处理18 h后(见图3中D)，蛋白纤维数量似乎有所减少并且不再紧密连接，在TEM网格上形成松散的缠绕网络。同时，也有研究显示，加热18 h会导致大多数长纤维分解为较短的碎片。由此可得出结论，12 h后Th T荧光的降低不是由于原纤维的全面破坏，也有可能是由于样品的局部胶凝。然而，在加热24 h后，所形成的蛋白纤维与12 h的蛋白纤维相似，但是比12 h的样品更短、更小且更致密。说明加热24 h可能会导致进一步断裂，甚至可能破坏原纤维结构，从而导致低的Th T荧光值。

2.1.4 Zeta电位的测定

在不同加热时间的卵白蛋白纤维的Zeta电位见图4。

图4 不同加热时间对蛋白纤维的Zeta电位的影响Fig.4 Effect of different heating time on Zeta potential

由图4可知，随着加热时间从0～12 h增加，与未加热的样品(Zeta=+35 mV)相比，OVA纤维的Zeta电位变得更高(Zeta>+40 mV)，这表明样品中的表面电荷有所增加。De Folter等[14]阐明了Zeta电位的增加是颗粒的聚集所致，这也可以从侧面证明加热加速了蛋白纤维的形成。具有较高Zeta电位的OVA纤维表明溶液颗粒之间存在较大的静电排斥力，从而使溶液更稳定且抗聚集。因此，用适当热处理的卵白蛋白纤维将在乳液小滴之间提供更高的能量屏障，从而提供更好的静电排斥力，这可以显著改善卵白蛋白在食品工业应用中的稳定性。

2.1.5 界面性质的测定

食物中油水界面或空气水界面的稳定性取决于界面的强度。目前，食品中使用的大多数小分子表面活性剂(例如吐温和蔗糖酯)通常具有相对较弱的界面强度，这往往会在食品存储过程中破坏界面的稳定性，从而导致食品结构的破坏(例如牛奶的乳脂化和反式脂肪的油脂渗出)。蛋白纤维是形状各向异性的材料，它们在油水界面上的相互作用不同于一般的球形颗粒或柔性聚合物，并且具有更强的相互作用。与天然蛋白质相比，热处理后的蛋白质由于蛋白质解折叠和表面疏水性增加而表现出较高的表面活性，可以有助于解决上述问题。

通过检测界面张力的变化研究了卵白蛋白纤维的界面性质。由图5可知，加热时间为6，12，18，24 h的蛋白纤维可以显著降低界面张力至19，18，20，21 mN/m的平衡值。所有样品的界面张力均随着吸附时间的延长而减少，这可能与界面处的蛋白质吸附有关。当加热时间超过12 h时，界面张力显著下降。这是因为在加热初期水解的蛋白分子量较小，扩散速率增加，因此可以获得较高的饱和界面张力。尽管过度加热可能会破坏蛋白质界面活性，但随着纳米纤维的形成，杂化系统的整体界面活性仍可以保持较高水平。Wan等[15]指出，与原始蛋白质相比，小的肽类物质(游离肽和/或肽聚集体)应具有更快的向界面的质量传输速率，从而更迅速地降低表面张力，蛋白纤维实际上就是其中的一种。就OVA纤维而言，它们的不规则形态可能提供柔软的特性，导致界面毛细作用力和颗粒之间的相互作用[16]。综合结构性质的结果，蛋白质原纤维的柔韧性和表面性质可能是解释蛋白质吸附和界面模量差异的两个重要参数，并且可能有助于更好地理解乳液形成和稳定过程中涉及的复杂机理。因此，OVA纤维的油-水界面行为表明蛋白纤维具有出色的乳化作用。

图5 不同加热时间的热聚合卵白蛋白自组装纤维在油/水界面吸附的界面张力的变化Fig.5 The changes in interfacial tension of adsorption on the oil/water interface of thermally polymerized ovalbumin self-assembled fibers with different heating time

2.2 蛋白纤维稳定乳液分析

2.2.1 乳液粒径及粒径分布

乳液的粒径见图6。

图6 不同加热时间对Pickering乳液的平均粒径(A)和粒径分布图(B)的影响Fig.6 Effects of different heating time on average particle size (A) and particle size distribution (B) of Pickering emulsion

由图6中A可知，加热后的蛋白纤维稳定的乳液粒径小于未加热的卵白蛋白所稳定的乳液粒径(平均粒径相差100 nm)，这可能是较大的Zeta电位引起的。并且由于加热增加了蛋白纤维的表面疏水性，从而增强了其吸附在油-水界面上的能力，在一定程度上可以减小乳液液滴的粒径大小。由图6中B可知，未加热的卵白蛋白所稳定乳液的粒径分布并不均匀，依然存在较大粒径的乳液液滴。由此可知，热聚合卵白蛋白自组装纤维具有较好的乳化特性，所制备的乳液粒径更为均匀。

2.2.2 乳液微观结构分析

由图7可知，在任何加热时间下的蛋白纤维所稳定的乳液都呈乳白色和均质状态，乳液相对稳定，且没有絮凝或聚结现象。同时，从显微镜图像可以观察到，由未经加热的卵白蛋白样品稳定的乳液(见图7中A)呈现出不均匀的尺寸分布，并具有一些较大的液滴。随着加热时间的增加，乳液液滴的形状变得均匀(6 h样品，见图7中B)，但仍有较大的液滴。加热12 h后，由OVA原纤维制备的乳液是均匀的，没有明显的聚集，并且液滴尺寸小，具有较好的分散性。在加热18 h和24 h时乳液液滴的形状与加热12 h的卵白蛋白形成稳定的乳液液滴的形状相似，但仍存在部分聚集和不同大小的液滴。通过卵白蛋白纤维稳定的乳液比通过卵白蛋白稳定的乳液更均匀，这可能是因为具有较高表面疏水性的蛋白原纤维更可能被吸附在油水界面上，并且随着纳米原纤维的添加，系统的粘度也相应增加[17]，也有助于稳定纤维及乳液液滴的稳定。

图7 在不同加热时间下OVA自组装原纤维稳定的新鲜Pickering乳液的微观形态观察Fig.7 The micromorphology observation of fresh Pickering emulsion stabilized by OVA self-assembled fibers at different heating time注：A为0 h,B为6 h,C为12 h,D为18 h,E为24 h。

2.2.3 界面蛋白吸附量(AP，%)和蛋白浓度(Γ)

不同加热时间对乳状液界面蛋白浓度的影响见图8。

图8 不同加热时间下卵白蛋白自组装纤维稳定的Pickering乳液界面吸附率(AP,%)和界面蛋白浓度(Γ)的变化Fig.8 The changes in interfacial adsorption rate (AP,%) and interfacial protein concentration (Γ) of Pickering emulsion stabilized by OVA self-assembled fibers with different heating time

由图8可知，在不同的加热时间下，AP的值分别为78.96%、85.64%、97.77%、88.04%和93.23%，这表明在乳化过程中有21.04%、14.36%、2.23%、11.96%和6.77%的卵白蛋白样品不参与系统的乳化过程。随着加热时间从0 h增加到12 h，被吸附到乳液的液滴界面上的蛋白也随着时间的增加而增加，表明卵白蛋白自组装纤维有良好的界面吸附百分比与蛋白质的乳化能力。与普通的蛋白质乳化剂不同，由于蛋白纤维具有较高的表面疏水性、可变的形态结构和较高的扩散系数，因此具有较高界面蛋白含量的乳液样品在乳液的制备和储存过程中将表现出更好的稳定性。当加热时间从0 h增加到12 h时，Г值从3.94 mg/m2增加到4.88 mg/m2，在随后的加热时间中略有下降，表明加热12 h的蛋白纤维可以稳定较大的界面面积。Tang等[18]还指出，界面蛋白与蛋白质在连续相之间的疏水相互作用可能会导致静电排斥力显著降低，从而导致Г值增加，这表明对OVA的热处理增强了蛋白之间的疏水相互作用，从而增加了乳化油滴的界面蛋白浓度。

2.2.4 乳液流变学特性分析

在食品工业的生产应用中，乳液极易变性且变性速率较快，若是在较小的线性粘弹区范围内对乳液的变性程度进行研究，还不足以解决实际问题以探究乳液性质的变化，因此需要对乳液进行振幅扫描。

由图9可知，随着振幅的增加，储能模量和损耗模量同时增加，表现出明显的频率依赖性，并且在任一振幅下储能模量均大于损耗模量，说明此时蛋白样品制备的乳液呈现出稳定的弹性行为，并且在增加的应变振幅下未出现结构的破坏，乳液的凝胶强度较强。这可能是因为卵白蛋白在酸-热处理中发生了展开和聚集，并且蛋白纤维通过提供2D网络增强了乳液的凝胶性质。由于蛋白溶液包裹的油滴可以通过界面相互作用与液相中未吸附到界面的蛋白质直接相互作用而形成凝胶网络，所以油滴在乳液的凝胶网络中可以起到加强其网络结构的作用。

图9 不同加热时间的OVA自组装原纤维稳定的新鲜乳液对应的动态剪切应力(A)、粘度(B)、储能模量(G)的储能模量(G′)(C)和损耗模量(G″)(D)的频率扫描Fig.9 The changes in dynamic shear stress (A), viscosity (B) and storage modulus (G') (C) and loss modulus (G") (D) for the fresh Pickering emulsion stabilized by OVA self-assembled fibers at different heating time注：实验在1 Hz的恒定频率或10%的恒定应变下进行。

所有的乳液都显示出粘度随着剪切速率的增加而降低(见图9中B)，因为乳液的表面覆盖有卵白蛋白纤维，当剪切力增加时，以蛋白纤维为首的3D网络逐渐消失，显示出典型的剪切稀化行为。流变结果表明，乳液的粘度随着加热时间的变化而变化。这是因为蛋白纤维的存在导致乳液小滴之间形成透明的凝胶状粘弹性结构网络，并且该网络结构变得更有凝聚力和更强，从而改变了乳液的粘度和稳定性。类似地，乳液表现出剪切稀化行为并具有较高的剪切粘度或剪切应力，这也可以通过3D网络的消失来解释。由图9中C和D可知，加热12 h的蛋白纤维表现出作为乳液稳定剂形成凝胶状乳液的最佳潜力。该结果证明，卵白蛋白纤维比卵白蛋白更适合用作食品应用的乳化剂。然而，需要注意的是，如果热处理过度，蛋白纤维的乳化性仍可能会降低。

3 结论

通过对2%浓度的OVA在pH为2的条件下加热不同时间制备热聚合蛋白自组装纤维，研究了蛋白纤维形成的机制，并且证明了其可以作为有效的乳化剂应用于乳液中。卵白蛋白经过不同时间的酸热处理后，Zeta电位的绝对值随着加热时间的增加而增加，并且加热后的卵白蛋白自组装纤维所稳定的乳液具有更小的平均粒径。乳液的粒径分布显示加热12 h的热聚合卵白蛋白自组装纤维具有最好的乳化能力，所稳定的乳液具有均匀且分散的油滴分布，这个结论也被CLSM的结果所证实。界面张力结果表明，OVA纤维具有静电相互作用，可以很好地吸附在油水界面，从而证明OVA纤维具有良好的乳化作用，通过AP(%)和界面蛋白浓度也证实了蛋白纤维的乳化能力，其所制备的乳液具有良好的稳定性。流变学结果表明乳液具有典型的剪切稀化行为和凝胶状结构。综合以上分析，热聚合OVA自组装纤维有望作为一个新型乳化剂应用于食品行业，对于将来蛋白质自组装纤维在功能性食品和饮料中的应用将具有重要意义，为在工业中更广泛的应用铺平了道路。