BMP9通过Orai1途径促进小鼠骨髓间充质干细胞骨向分化

周家旺，陆国海，李晓林*

(1.南通大学附属吴江医院，苏州市第九人民医院 骨科，江苏 苏州 215200；2.南京医科大学附属苏州医院，苏州市立医院(北区)骨科，江苏 苏州 215008)

骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)是近年来新发现的、BMPs家族中骨诱导能力最强的蛋白，是目前骨组织工程中研究的热点，有关BMP9成骨诱导的机制仍不完善[1-2]。Orai1最初是从免疫细胞中鉴定而来，越来越多的研究表明Orai1在其他类型细胞中也起着重要作用的观点[3-4]。新近的研究发现Orai1在骨骼代谢中具有重要作用。Orai1基因敲除小鼠出现明显的骨质疏松现象，进一步研究发现Orai1功能的抑制可导致破骨细胞和成骨细胞分化受损[5-6]。而有关Orai1在成体干细胞中的功能研究仍无研究报道。本研究拟通过体内外实验研究Orai1的功能，并探索Orai1在BMP9诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性BALB/c裸鼠30只，体质量15～25 g，6周龄(南京青龙山实验动物繁殖场，动物合格证号：苏20180079)。其中6只BALB/c裸鼠用于BMSCs细胞提取，24只用于体内实验。

1.1.2 实验试剂：BMP9(Santa Cruz公司)；碱性磷酸酶ELISA试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；胎牛血清、高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；RNA提取试剂盒，Trizol(Life Technologies公司)；转染试剂Lipofectamin2000TM(Invitrogen公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒、茜素红染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Orai1单克隆抗体(Abcm公司)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(北京中衫金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的获取和培养：0.5%戊巴比妥麻醉后利用断颈法处死裸鼠后，取长短骨骨髓组织置于三抗DMEM培养基中，通过200目滤网筛去掺杂物，将悬浮细胞以1 000 r/min离心5 min，PBS吹打后移入含新鲜培养液的培养瓶中，并放入37 ℃、5%的CO2细胞培养箱中培养，细胞汇合80%时胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 BMP9诱导BMSCs成骨分化：取1.0×105个/孔的第3代BMSCs接种于24孔板中，待细胞贴壁后，更换含10-5mol/L BMP9的含10% FBS培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。

1.2.3 转染与实验的分组：取1.0×105个/孔第3代BMSCs接种于24孔板中，利用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养，当细胞汇合40%时滴入Ad-si-Orai1或Ad-RFP(si-NC)，感染24 h后加入10-5mol/L BMP9。根据条件将实验分为4组：对照组、10-5mol/L BMP9组、空白+si-Orai1组和10-5mol/L BMP9+si-Orai1组。

1.2.4 骨诱导染色：骨向诱导21 d后，倒去细胞培养基，PBS冲洗3遍，10%甲醛 10 min后蒸馏水清洗3次，室温下加入0.1%茜素红-Hris-Hcl染液，放置30 min后蒸馏水清洗。同理，在骨向诱导7 d时利用10%甲醛 10 min后蒸馏水清洗3次，室温下滴加底物作用液10 min后蒸馏水清洗后加入2%碱性磷酸酶染色，水洗封固，倒置相差显微镜观察。

1.2.5 RT-qPCR检测Orai1、OPN、OCNmRNA表达：骨向诱导21 d后，按细胞裂解后Trizol试剂盒说明书分离总RNA，将总RNA反转录cDNA，然后上机进行实时定量PCR，GAPDH作为内参，所用引物序列：Orai1上游，5′-TTTGCCCTCATGATCAGCAC-3′，下游，5′-TTGGCGACGATGACTGATTC-3′；RUNX2上游，5′-CCGAAATGCCTCCGCTGTTATG-3′，下游，5′-TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTCC-3′；OPN上游，5′-GCAGAGAGCGAGGATTCTGT-3′，下游，5′-TGTA GGGACGATTGGAGTGA-3′；OCN上游，5′-AGCAGC TTGGCCCAGACCTA-3′，下游，5′-TAGCGCCGGAGT CTGTTCACTAC-3′；GAPDH上游，5′-GGCTGCCCAG AACATCAT-3′，下游，5′-CGGACACATTGGGGGTA G-3′。

1.2.6 Western blot检测Orai1蛋白表达：骨向诱导21 d后，细胞裂解后BCA法提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度，调整蛋白浓度后进行SDS-PAGE，将目的蛋白转移至PVDF膜后加入单克隆抗体Orai1(1∶1 000)孵育3 h，TBST清洗后孵育二抗过夜，滴加显色剂后进行曝光。

1.2.7 体内实验：将羟基磷灰石/聚乳酸/壳聚糖材料制备成5 mm×3 mm×3 mm圆柱状，1.0×105个BMSCs通过微型移液枪植入支架，在DMEM培养基中进行培养48 h。24只BALB/c裸鼠分3组：BMSCs+支架组；Ad-BMP9+支架组；Ad-BMP9/si-Orai1+支架组，复合材料植入裸鼠背部皮下组织，4周后取出复合材料进行HE染色和Masson染色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 BMP9对Orai1表达的影响

随着时间增加，Orai1mRNA表达逐渐升高，从第5天开始显著高于对照组(P<0.05)(图1)。基因敲减后Orai1基因和蛋白表达显著降低(P<0.05)(图2A,B)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with vehicle group图1 不同时间点Orai1基因表达Fig 1 Gene expression of Orai1 at different time n=3)

A.comparison of Orai1 gene expression levels between vehicle group and BMP9 group before and after Orai1 gene knockdown;B.comparison of Orai1 protein expression levels between vehicle group and BMP9 group before and after Orai1 gene knockdown;*P<0.01 compared with vehicle group

2.2 Orai1对BMSCs骨向分化的影响

BMP9显著提高钙盐沉积和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)生成，Orai1敲减后显著降低这一现象(P<0.05)(图3A,C)；同时，骨向诱导21 d时钙盐沉积和7 d时ALP化学定量检测结果提示Orai1敲减后BMP9骨向诱导效果显著降低(P<0.05)(图3B,D)；Orai1敲减后能显著降低BMP9诱导的骨性标志物RUNX2、OPN和OCN mRNA的表达(P<0.05)(图3E～G)。

A.BMP9 significantly increased calcium deposition and ALP production;B.the results of calcium salt deposition on the 21st day of osteotropism induction and ALP chemical quantitative detection on the 7th day beforer Orai1 knockdown;C.Calcium deposition and ALP production decreased significantly after Orai1 knockdown;D.the results of calcium salt deposition on the 21st day of osteotropism induction and ALP chemical quantitative detection on the 7th day after Orai1 knockdown;E.the mRNA expression of bone marker Runx2 induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;F.the mRNA expression of bone marker OPN induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;G.the mRNA expression of bone marker OCN induced by BMP9 decreased significantly after Orai1 knockdown;*P<0.05,**P<0.01 compared with vehicle group

2.3 Orai1在体内对BMSCs骨向分化的影响

4周后单纯细胞组鲜有成块骨组织长出，而BMP9组可见明显的板状骨块生存，并可见大量骨基质，Orai1敲减后仍可见少量骨基质及板状骨形成，较BMP9组显著减少；同时BMP9组可见大量红染的骨基质及骨块形成，而Orai1敲减后骨基质和板状骨量明显减少(图4)。

NB.new bone;BM.bone matrix;S.scaffold material图4 各组裸鼠异位成骨的组织学观察Fig 4 Histological observation of heterotopic osteogenesis in nude mice(×400)

3 讨论

BMP9是新近发现的BMPs家族成员之一，目前为止，BMPs 2/4/6/7/9已被证明具有成骨潜能，其中BMP9具有最强的成骨潜能[7]。新的证据表明，BMP9除了具有成骨活性外，还具有广泛的生物学功能，包括干细胞分化、血管生成、神经病变、肿瘤发生和代谢[8-9]。BMP9的功能和机制需深入研究。因此，BMP9具有非常大的应用潜能。

Ca2+在骨向分化过程中起重要作用。Orai1是一种具有高度选择性的钙离子通道蛋白，Orai1促进细胞外Ca2+内流主要通过钙库依赖的钙释放激活钙通道或非钙库依赖的花生四烯酸调节的钙通道白三烯C4调节的钙通道[10]。研究显示，成骨细胞介导钙和磷酸盐沉积于Ⅰ型胶原基质，从而形成高矿化骨基质。细胞外高浓度Ca2+在体外可促进BMSCs成骨分化[11]。已知维生素D，钙稳态和骨矿化的主要调节因子，在体外能现在刺激BMSCs成骨分化[12-13]。维生素D和雌激素通过引起细胞外钙离子快速内流发挥作用[14-15]。因此，Orai1可能通过允许胞外Ca2+内流参与信号传导以促进骨向诱导，并在诱导过程中发挥关键作用。

Orai1是否在BMP9诱导的MSCs骨向分化过程中产生作用仍不清楚。本研究中，研究者首先在细胞培养基中加入10-5mol/L BMP9，构建骨向诱导条件，观察不同时间段Orai1基因表达，结果发现随着时间增加，Orai1 mRNA表达逐渐升高，从第5天开始显著高于对照组，提示Orai1参与BMP9诱导的BMSCs骨向分化过程。为进一步验证Orai1功能，通过基因敲减技术发现Orai1敲减后能显著抑制BMP9诱导的BMSCs骨向分化，提示Orai1能介导BMP9诱导的骨向分化功能。为了验证Orai1在体内是否有相似功能，通过将细胞复合组织工程支架，本研究发现Orai1敲减后能显著抑制BMP9诱导的骨向分化能力，从组织学层面验证了Orai1介导BMP9诱导的骨向分化过程。

综上，本研究通过体内外实验探索了Orai1在BMP9诱导的BMSCs骨向分化过程中的功能，为BMP9的机制研究提供新的依据。